鄧慧莉，孫 云，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州350002)

茶葉以其獨特的香氣滋味而名聞天下。香氣是茶葉品質(zhì)的重要衡量指標，20 世紀50年代中期開始對茶葉香氣展開較為系統(tǒng)的研究［1－3］。由于技術(shù)與設(shè)備的限制，早期研究僅局限于茶葉香氣的提取方法及組分鑒定等。近年來，由于微量分析技術(shù)的快速發(fā)展，對茶葉加工和貯藏中的香氣變化、不同茶類和品種的香氣差異以及香氣形成機理等方面都展開了研究［4－7］。

茶葉香氣的合成途徑較為復雜，在已知的香氣形成途徑中，由糖苷類物質(zhì)水解生成相應的醇類物質(zhì)受到廣泛關(guān)注。國內(nèi)外研究表明［8－11］，β-櫻草糖苷是茶葉醇系香氣物質(zhì)的重要前體，β-櫻草糖苷酶水解β-櫻草糖苷的過程對茶葉醇系香氣的形成具有關(guān)鍵作用。本文綜述了β-櫻草糖苷酶對醇系香氣影響的研究進展，并展望了β-櫻草糖苷酶的應用前景，以期為β-櫻草糖苷酶的深入研究提供依據(jù)。

1 茶葉醇系香氣的形成

醇類化合物種類和相對含量在各茶類中均較高，其中橙花叔醇、植醇、芳樟醇及其氧化物、脫氫芳樟醇、香葉醇、苯乙醇、雪松醇、異植醇是各茶類共有的香氣成分。各茶類主要特征香氣物質(zhì)不同，如紅茶香氣的萜烯醇類物質(zhì)主要有芳樟醇、香葉醇、橙花醇等。

茶葉中醇類化合物的形成與轉(zhuǎn)化有多條途徑，制茶發(fā)酵過程的酶促氧化作用引起一系列次生氧化與伴隨作用［12］。茶葉中包括游離態(tài)、結(jié)合態(tài)兩種醇系香氣，醇系香氣的主要來源是結(jié)合態(tài)香氣，包括萜烯醇類和芳樟醇類化合物，它們在茶鮮葉中基本以糖苷形式存在［13］。糖苷酶類能有效水解糖苷類香氣前體，并釋放出相應的醇系香氣。

1.1 糖苷類香氣前體

1.1.1 茶葉中的糖苷類香氣前體 糖苷類香氣前體是以與單糖或雙糖結(jié)合的配基形式存在。目前已有20 多種糖苷類香氣前體得到分離鑒定，大部分是二糖苷和單糖苷，其中以β-櫻草糖苷為主的二糖苷含量高于以β-葡萄糖苷為主的單糖苷［11，14，15］。Guo et al［16］首次從茶葉中分離得到香氣前體香葉基-β-櫻草糖苷。Moon et al［17］從茶葉中分離出順、反式芳樟醇氧化物和8-羥基牻牛兒基-β-櫻草糖苷。Yano et al［18］、Kobayashi et al［19］、Nishikitani et al［20］、Guo et al［21］、Sakata et al［22－23］、Ma et al［24］、張正竹等［25］利用柱層析法分離茶葉中的β-櫻草糖苷，發(fā)現(xiàn)主要苷元是順-3-己烯醇、芳樟醇及其氧化物，并且結(jié)合在β-櫻草糖苷的苷元多于β-葡萄糖苷，說明β-櫻草糖苷是茶樹中更為重要的前體物質(zhì)。Wang et al［26］測定紅茶加工過程中β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶的活性及釋香能力均比β-葡萄糖苷酶強。Yang et al［27］在綠茶加工過程中添加外源β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，研究酶對香氣釋放的影響，認為β-櫻草糖苷酶釋香能力比β-葡萄糖苷酶強，這與Wang et al［26］的研究結(jié)果一致。

1.1.2 茶葉加工中糖苷類香氣前體的變化 糖苷類香氣前體的含量與加工過程緊密聯(lián)系。Fischer et al［28］認為許多糖苷類香氣前體未被水解，有些鮮葉中并不存在的前體物質(zhì)在加工過程中逐漸形成，說明茶葉加工過程存在糖苷的合成反應。Wang et al［14］研究了紅茶加工中糖苷含量的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)鮮葉中櫻草糖苷的含量遠遠高于葡萄糖苷，成品茶中櫻草糖苷含量很低，而葡萄糖苷含量卻達到鮮葉含量的70%，說明β-櫻草糖苷是紅茶的主要香氣前體物質(zhì)。烏龍茶曬青過程中，很多糖苷類物質(zhì)含量上升，成品茶的糖苷達到最高值［26］。張正竹等［29］檢測綠茶加工中糖苷含量變化，認為成品綠茶保留鮮葉中77%的香氣前體物質(zhì)。

1.2 茶葉中的糖苷酶類

分布于茶葉細胞中的糖苷酶種類豐富，其中香氣形成的關(guān)鍵酶是β-櫻草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶［30］。

Sakata et al［31］通過純化茶鮮葉粗酶提取物，得到β-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶，首次證明茶葉中存在參與香氣釋放的β-葡萄糖苷酶。Guo et al［32］首次在茶葉中發(fā)現(xiàn)香氣前體β-櫻草糖苷。為了進一步探明香氣釋放相關(guān)內(nèi)源酶系，Ogawa et al［30］、Guo et al［33］、Ijima et al［34］層析純化茶鮮葉粗酶提取物，分別從不同鮮葉品種中得到了β-櫻草糖苷酶。

2 β-櫻草糖苷酶研究現(xiàn)狀

β-櫻草糖苷酶是水解香氣前體生成相應香氣成分的雙糖苷水解酶。已有研究表明［33，35］，β-櫻草糖苷酶對茶葉中醇系香氣的釋放至關(guān)重要。

2.1 β-櫻草糖苷酶活性

2.1.1 專一性 β-櫻草糖苷酶的專一性表現(xiàn)在對β-櫻草糖基部分的底物特異性。Guo et al［32］研究β-櫻草糖苷酶對不同底物的水解活性，發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶對(S)-芳樟醇-β-櫻草糖苷等具有較高的活性，說明其對底物具有相對專一性。Matsumura et al［15］進一步研究β-櫻草糖苷酶的專一性，以人工合成的櫻草糖苷、甾菜糖苷為材料證明β-櫻草糖苷酶對配糖體和糖基均具有嚴格特異性。Ijima et al［34］研究發(fā)現(xiàn)，β-櫻草糖苷酶的底物專一性是對含有1 －6 糖苷鍵的雙糖苷的相對專一性。Han et al［36］通過構(gòu)建β-櫻草糖苷酶3D 模型，發(fā)現(xiàn)僅β-櫻草糖苷可與其對接的結(jié)合位點，從分子動力學角度驗證了β-櫻草糖苷酶的基團專一性。

2.1.2 影響β-櫻草糖苷酶活性的因素 酶促反應速度受pH、溫度、酶濃度、激活劑、抑制劑等多種因素影響。Guo et al［21］從粗酶中精制分離出β-櫻草糖苷酶并研究其性質(zhì)，認為β-櫻草糖苷酶的相對分子質(zhì)量約為61 ku，最適溫度為45 －50 ℃，最適pH 為5 －7，穩(wěn)定溫度在45 ℃以下。

茶葉中糖苷酶活性還受到品種、生態(tài)環(huán)境、采摘方式、加工等因素的影響。新梢不同葉位間β-櫻草糖苷酶活性表現(xiàn)為:芽＞第1 葉＞第2 葉＞第3 葉＞莖梗。Ogawa et al［37］研究表明，嫩葉中的β-櫻草糖苷酶及其香氣前體含量很高，并隨著葉齡增加而降低。

2.2 β-櫻草糖苷酶分子生物學研究

早期對β-櫻草糖苷酶的研究集中于分離純化、加工中變化規(guī)律以及分析不同品種間的差異性等生理生化水平。近年來，相關(guān)研究已逐步向分子水平發(fā)展。費月［38］克隆茶樹β-櫻草糖苷酶基因，cDNA 全長為1729 bp，ORF 框為1524 bp，編碼507 個氨基酸，并將β-櫻草糖苷酶的ORF 框片段插入原核表達載體中，轉(zhuǎn)化至表達菌株，經(jīng)過誘導后表達出融合蛋白。趙麗萍等［39］利用熒光定量實時PCR 技術(shù)，檢測了龍井43 新梢的不同部位葉片中β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表達量，發(fā)現(xiàn)一芽一葉中β-櫻草糖苷酶基因表達量很低，一芽二葉最高，而后隨著葉齡增加而降低;β-葡萄糖苷酶的基因表達量遠遠高于β-櫻草糖苷酶。張廣輝［40］研究UV-B 處理對β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表達以及離體茶樹葉片香氣的影響，認為短時間UV-B 處理可以刺激糖苷類水解酶的基因活性，從而使更多香氣前體水解并釋放香氣。Shi et al［41］研究表明，經(jīng)過茉莉酸甲酯處理的龍井43 茶樹葉片中β-櫻草糖苷酶表達水平增加3 倍。

深入研究茶樹的基因表達，可以進一步揭示茶葉香氣形成的分子機理，利用人工手段促使糖苷酶類活性變化朝著提高茶葉品質(zhì)的方向發(fā)展，為研制香型獨特高長的優(yōu)質(zhì)茶葉產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)［42－46］。

2.3 β-櫻草糖苷酶對醇系香氣形成的影響

β-櫻草糖苷酶是糖苷類水解關(guān)鍵酶，能夠?qū)Ｒ恍运猞?櫻草糖苷，這與醇系香氣的形成緊密相關(guān)。首次發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶的香氣前體后［32］，國內(nèi)外學者通過純化得到β-櫻草糖苷酶并對其性質(zhì)進行研究，從而進一步探明香氣釋放相關(guān)水源酶系［8，33，34］。Mizutani et al［47］研究發(fā)現(xiàn)，β-櫻草糖苷酶可能位于細胞壁上，而香氣前體在液泡中，當茶葉組織受到損傷或破壞時，酶觸碰不同香氣前體后釋放香氣。Sakata et al［22］在對烏龍茶醇系香氣形成機理的研究中，分離并鑒定出了香葉醇、芳樟醇及其氧化物Ⅰ和Ⅱ、2-苯乙醇、芐醇等主要醇類香氣前體，利用丙酮粉末、β-D-葡萄糖苷與柚苷酶分別與香葉醇－櫻草糖苷、(S)-芳樟醇—櫻草糖苷反應，發(fā)現(xiàn)丙酮粉末水解香葉醇—櫻草糖苷、(S)-芳樟醇－櫻草糖苷有較高的活性，說明除了β-葡萄糖苷酶，還有其他和茶葉醇系香氣形成相關(guān)的酶。進一步的試驗發(fā)現(xiàn)［22］，β-櫻草糖苷酶對櫻草糖苷的水解活性與丙酮粉末類似，而且香葉基-β-櫻草糖苷的水解率明顯高于香葉基-β-D-糖苷，表明β-櫻草糖苷酶是使茶葉醇系香氣得以釋放的主要酶。

3 問題與展望

在逐漸掌握β-櫻草糖苷酶酶學特性的過程中，對其底物β-櫻草糖苷的研究也獲得了相應成果。主要測定方法有對硝基苯酚法和甲基傘形酮法，由于底物獲得難度較大，目前暫時沒有明確測定β-櫻草糖苷酶活性的方法，研究結(jié)果難以進行比較分析。為了進一步研究不同環(huán)境中β-櫻草糖苷酶活和表達量的變化，尋找酶與香氣成分之間的相關(guān)性及獲得底物的方法也是研究的重點。從分子生物學角度研究β-櫻草糖苷酶有利于認識其分子本質(zhì)及表達調(diào)控機理，并運用于茶葉加工中。在對香氣品質(zhì)的調(diào)控中，通過外源添加β-櫻草糖苷酶不可調(diào)控的因素較多，通過分子生物學研究茶樹β-櫻草糖苷酶可以有效解決這個問題，也為選育優(yōu)質(zhì)茶樹品種奠定基礎(chǔ)。

茶葉中糖苷類香氣前體物質(zhì)含量較為豐富并且難以得到標樣，要對其進行定性定量比較困難。通過酶解方法得到香氣物質(zhì)可以提高茶葉香氣品質(zhì)，如何充分利用這門技術(shù)釋香是今后研究的重點?；蚬こ碳夹g(shù)可以有效地克服糖苷酶在應用中的局限性，因此通過基因工程手段將為醇系香氣釋放提供技術(shù)保障。

進一步開展糖苷酶在茶樹栽培及加工過程中的變化、糖苷酶多樣性及作用機理等相關(guān)研究將更好地揭示茶葉香氣形成機理。而且，研究糖苷酶在茶葉加工過程中的變化規(guī)律可以豐富茶葉加工理論。另外，酶在細胞中的定位分析研究有待進一步深入，如何防止其他細胞組分的干擾，分離純化特定細胞器，有利于酶的研究。隨著對糖苷酶研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)其對茶葉深加工、食品、化工、制藥等多領(lǐng)域具有深遠的影響。利用糖苷酶提高茶飲料香氣，并改善茶飲料風味。糖苷酶處理的食品也具有獨特風味，預示著其在茶葉深加工和食品風味改良等方面有廣闊的應用前景。

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