劉元東， 袁樂， 余潤蘭

（中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083）

大部分的發(fā)酵產(chǎn)物都積累于菌體細(xì)胞內(nèi)部，要獲得高濃度產(chǎn)物，首先就要獲得高細(xì)胞密度.20世紀(jì)90年代高密度培養(yǎng)技術(shù)已成為發(fā)酵工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一，隨著市場經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，人們需求日益提高，高質(zhì)量和短周期生產(chǎn)發(fā)酵劑行業(yè)迅速增加，以最低的成本消耗獲得最高的細(xì)胞濃度及其產(chǎn)物收益成為目前整個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵行業(yè)的關(guān)注焦點(diǎn)，因此關(guān)于高密度培養(yǎng)技術(shù)和工藝方面的研究越來越熱.

高密度培養(yǎng)技術(shù)最早用于酵母細(xì)胞培養(yǎng)提高生物量，利用烷烴或有機(jī)廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白及乙醇[1].隨著許多重要工業(yè)微生物的遺傳背景和生理特性被逐漸認(rèn)識(shí)，加上分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，使微生物高密度培養(yǎng)技術(shù)在其它更多領(lǐng)域得到了更廣泛的應(yīng)用.

1 高密度培養(yǎng)的概述

高密度培養(yǎng)技術(shù)只是一個(gè)相對(duì)概念，能讓菌體發(fā)酵密度較普通培養(yǎng)有顯著提高的技術(shù)都可以稱為高密度培養(yǎng)技術(shù)[2].但是由于培養(yǎng)過程中選擇的菌種菌株不同，培養(yǎng)目標(biāo)也存在較大的差異，因此高密度培養(yǎng)的最終菌體生物量也無法用一個(gè)確切的值或范圍來界定，根據(jù)廣義的概念來講，凡是細(xì)胞密度比較高或以至接近其理論值的均可稱為高細(xì)胞密度.

在微生物培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和代謝產(chǎn)物的積累是導(dǎo)致微生物生長停止的主要因素，而高密度培養(yǎng)技術(shù)不僅能提高微生物的可培養(yǎng)性、增加菌體活性，而且可以提高單位體積培養(yǎng)液中菌體數(shù)量和代謝產(chǎn)物濃度、更高效利用營養(yǎng)物質(zhì)、縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資，從而降低成本，節(jié)約資源，減少污染，提高綜合生產(chǎn)效率.

2 微生物高密度培養(yǎng)的限制性因素及優(yōu)化策略

影響微生物高密度培養(yǎng)的因素有很多，主要包括：接種量、培養(yǎng)基組成、有害代謝產(chǎn)物的積累、培養(yǎng)條件等.

2.1 接種量

不同的接種量對(duì)菌體活性影響不同，從而影響菌體的適應(yīng)能力和生長速率.在營養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下適當(dāng)加大接種量能加快菌體生長，縮短達(dá)到最高菌體濃度所需的時(shí)間.胡爽等人研究發(fā)現(xiàn)，在200 L的發(fā)酵罐中，分別接種5%和10%的大腸桿菌，接種量為10%的最終菌濃度較5%的有顯著提高[3].

2.2 培養(yǎng)基

普通微生物的培養(yǎng)基類型主要有3種：合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和復(fù)合型培養(yǎng)基.復(fù)合型培養(yǎng)基通常采用天然原料，其化學(xué)組成不明確且不可調(diào)控，因此不適合用于微生物的高密度培養(yǎng).合成培養(yǎng)基的化學(xué)成分明確且質(zhì)量穩(wěn)定，適合于研究微生物基本代謝途徑和探索代謝過程中物質(zhì)變化規(guī)律，但是合成培養(yǎng)基營養(yǎng)較為單一，也不利于微生物的高密度培養(yǎng).為了避免以上2種培養(yǎng)基的缺點(diǎn)，保持其優(yōu)點(diǎn)，就出現(xiàn)了半合成培養(yǎng)基，半合成培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基中添加少量天然營養(yǎng)物（如酵母粉、蛋白胨、氨基酸、無機(jī)鹽等），這些天然物質(zhì)能有效促進(jìn)菌體細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物合成.半合成培養(yǎng)基更常用于微生物高密度培養(yǎng).

在微生物高密度培養(yǎng)過程中，充足的營養(yǎng)供給是微生物快速生長和代謝產(chǎn)物大量合成的基礎(chǔ)，它為微生物的正常生長提供碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因子和水等基礎(chǔ)物質(zhì)，這些是微生物菌體生長繁殖以及合成代謝產(chǎn)物所必需的物質(zhì).但是當(dāng)普通培養(yǎng)的體系中營養(yǎng)成分濃度過高時(shí)，菌體生長會(huì)受到明顯抑制[4]，不利于微生物菌體積累.另外培養(yǎng)基各成分比例也要恰當(dāng)，特別是碳氮比例.在分析營養(yǎng)源對(duì)大腸桿菌生長的影響時(shí)，文獻(xiàn)[5-6]研究表明，碳氮比較低，在培養(yǎng)初期菌體自身生長繁殖旺盛，產(chǎn)生大量代謝廢物，抑制菌體后期生長，甚至容易造成菌體提前衰老自溶；而碳氮比過高，菌體利用的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于合成積累代謝產(chǎn)物，菌體生長代謝緩慢.

因此，需要根據(jù)培養(yǎng)微生物的生理特性來選擇合適的營養(yǎng)組成物質(zhì)和控制適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)濃度，這是解決限制高密度培養(yǎng)因素的重要策略之一.

2.3 代謝產(chǎn)物

分批培養(yǎng)微生物過程中，經(jīng)過一定時(shí)間，細(xì)胞超過一定濃度時(shí)，菌體生長會(huì)變緩甚至停止.分析其生長曲線可知，微生物生長停止的一個(gè)主要原因就是代謝產(chǎn)物的積累.另外，有害副產(chǎn)物的出現(xiàn)也會(huì)嚴(yán)重影響菌體生長和產(chǎn)物形成.在大腸桿菌、乳酸菌等細(xì)菌的培養(yǎng)過程中，菌體利用葡萄糖產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物如乙酸、乙醇和二氧化碳等，對(duì)菌體生長繁殖具有抑制作用[7].文獻(xiàn)[8]研究表明，當(dāng)乙酸濃度大于5 g/L時(shí)，大腸桿菌菌體生長緩慢，最大菌濃度下降；當(dāng)其濃度超過14 g/L時(shí)，菌體停止生長.

在微生物高密度培養(yǎng)過程中，可通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成、調(diào)整碳源種類和比例、維持較高的溶解氧等方式，來緩解代謝物積累帶來的抑制作用.另外，目前也已經(jīng)有研究通過代謝工程技術(shù)構(gòu)造工程菌改變其代謝途徑，從而阻止抑制物產(chǎn)生.比如有文獻(xiàn)[9]提到，乙酸的分解代謝過程需要許多酶共同參與完成，而通常情況下，葡萄糖能夠抑制這些酶的活性，所以在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)大腸桿菌等細(xì)菌時(shí)，這些乙酸分解酶都處于失活狀態(tài)，使得乙酸積累，抑制微生物生長繁殖.因此，解除葡萄糖對(duì)乙酸分解酶的抑制就可以不斷消耗乙酸，從而解除乙酸對(duì)菌體生長繁殖的抑制作用.文獻(xiàn)[10]研究發(fā)現(xiàn)，某種突變菌株就能解除葡萄糖抑制作用，在消耗利用葡萄糖的同時(shí)不斷地分解消耗代謝產(chǎn)生的乙酸.

另外，采用降溫、流加營養(yǎng)物或者透析等方法，可以有效降低抑制物質(zhì)的產(chǎn)生.

2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件是影響菌體細(xì)胞生長繁殖的重要因素，它能影響菌體的生理生化特性，從而影響其高密度培養(yǎng).在不同環(huán)境條件下，各種不同微生物在不同的培養(yǎng)階段所需條件都是不同的，因此應(yīng)該根據(jù)微生物生理特性、結(jié)合培養(yǎng)目標(biāo)、充分分析并確定最佳的培養(yǎng)條件，以達(dá)到高細(xì)胞密度.

2.4.1 溫 度

溫度對(duì)于微生物的影響很大，它不僅可以改變菌體內(nèi)各種反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)性質(zhì)，而且能影響培養(yǎng)液的物理特性，從而影響菌體生長繁殖和代謝活動(dòng)，同時(shí)，它能影響培養(yǎng)體系中各種物理參數(shù)特性，間接對(duì)菌體產(chǎn)生一定影響.在一定范圍內(nèi)溫度升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶催化和化學(xué)反應(yīng)速率都會(huì)加快，菌體生長也會(huì)加快，同時(shí)營養(yǎng)物和代謝物的溶解度提高，細(xì)胞膜流動(dòng)性增大，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排除.一般溫度每升高10℃，生化反應(yīng)速率會(huì)增加1倍.但是超過一定溫度后繼續(xù)升溫，會(huì)使蛋白質(zhì)和核酸等受到不可逆的損害，從而抑制菌體生長代謝甚至導(dǎo)致死亡.因此，通常采用121℃、20 min來滅菌，因?yàn)樵?21℃條件下幾乎所有的微生物都已經(jīng)死亡.

最適宜溫度并不是一個(gè)特定值，通常是一個(gè)范圍區(qū)間，也不是一個(gè)菌種的特征性常數(shù)，它會(huì)隨著培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)目標(biāo)和菌體生長階段的不同而改變.如，主要的浸礦菌氧化亞鐵硫桿菌屬于嗜熱中溫菌，其最適浸礦溫度為30～35℃，而同樣屬于浸礦菌的高溫嗜熱菌金屬硫化葉菌的最適宜浸礦溫度為65℃[11].

2.4.2 pH值

穩(wěn)定的pH值是菌體維持在最佳生長狀態(tài)的必要條件.高密度培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物形成積累，都會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境pH發(fā)生變化，改變營養(yǎng)物質(zhì)分子的電離狀態(tài)，影響微生物利用效率[12].另一方面，培養(yǎng)環(huán)境的pH變化會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)pH值改變，從而影響細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的狀態(tài)和性質(zhì)，最終對(duì)菌體生長代謝活動(dòng)產(chǎn)生負(fù)面影響.

因此，必須對(duì)培養(yǎng)基的pH條件進(jìn)行控制，使其保持在一定的范圍內(nèi).向培養(yǎng)體系中添加緩沖液提高緩沖能力能有效控制pH值的變化幅度，這樣使得微生物處于最佳的生長繁殖狀態(tài)，有利于積累大量菌體數(shù)量或產(chǎn)生目標(biāo)代謝產(chǎn)物.另外，在微生物高密度培養(yǎng)過程中，也有人提出通過流加新鮮培養(yǎng)基來調(diào)節(jié)pH值，成功控制pH值范圍.

2.4.3 溶氧濃度

溶氧濃度的高低能明顯影響菌體生長、產(chǎn)物合成以及產(chǎn)物性質(zhì).在高密度培養(yǎng)過程中，菌體密度不斷增大，耗氧量也隨之加大，使得培養(yǎng)基中溶氧水平逐漸下降，造成供氧不足，不利于各種代謝活動(dòng)，從而抑制菌體生長和產(chǎn)物生成.

40%左右的溶氧水平最適合嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的高密度培養(yǎng)[13].但是氧是一種難溶氣體，常溫常壓下純水中的氧容量僅7 mg/L，因此在試驗(yàn)中常常會(huì)用搖床、發(fā)酵罐和通氣設(shè)備等來增加溶氧[14].但是也有資料[15]曾報(bào)道在高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌過程中，溶氧水平并不是越高越好，溶解氧高于10 mg/L時(shí)，菌體濃度和色氨酸合成酶活力存在降低趨勢，從而對(duì)產(chǎn)物的形成造成不利影響.因此，需要根據(jù)不同微生物特性和培養(yǎng)目標(biāo)來確定最佳溶氧濃度.

3 高密度培養(yǎng)方式及其應(yīng)用

培養(yǎng)方式對(duì)菌體積累也有很大的影響.一般微生物高密度培養(yǎng)方式主要有：透析培養(yǎng)、細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)等，其中補(bǔ)料分批培養(yǎng)研究最為成熟且應(yīng)用最為廣泛.

3.1 透析培養(yǎng)

現(xiàn)在的透析培養(yǎng)其實(shí)是一種 “Nutrient-split”補(bǔ)料策略[16]，即將培養(yǎng)基分成2部分，一種是含有必須營養(yǎng)物的濃縮型培養(yǎng)液，另一種是基本只含用來平衡滲透壓的無機(jī)鹽溶液.同時(shí)培養(yǎng)器也分為培養(yǎng)室和透析室2部分.濃縮型培養(yǎng)液以分批或連續(xù)的方式加入培養(yǎng)室為微生物提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)，半透膜能除去有害代謝產(chǎn)物，解除其積累帶來的抑制作用；無機(jī)鹽溶液則加入透析室以維持滲透壓平衡.

透析培養(yǎng)能明顯延長對(duì)數(shù)期的菌體增殖、增大穩(wěn)定期的細(xì)胞積累、提高營養(yǎng)物的利用率，且在培養(yǎng)室中可獲得密度較高且較為純化的菌體以及高分子目標(biāo)產(chǎn)物.文獻(xiàn)[17]曾利用透析培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)不同微生物（包括葡萄球菌，大腸桿菌，極端微生物等），細(xì)胞密度約為普通發(fā)酵方式的30倍.但是，透析培養(yǎng)反應(yīng)器本身還需要透析組件及一些其他輔助裝置，因此設(shè)備投資較大，操作技術(shù)要求較高.透析培養(yǎng)在生產(chǎn)方面一般用于營養(yǎng)要求嚴(yán)格、培養(yǎng)條件復(fù)雜的淋球菌的濃縮培養(yǎng)，以及培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液生產(chǎn)病毒、毒素和酶制劑等[18].近年，Baehr等[19]將此方式成功應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究，用透析式搖瓶小規(guī)模流加培養(yǎng)大腸桿菌BL21（DE3），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過程中代謝副產(chǎn)物大幅度減少，產(chǎn)酸途徑明顯受抑制，較分批培養(yǎng)過程，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高約1 000倍，菌體濃度增加約200倍.

3.2 細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)

微生物培養(yǎng)過程中采用一定方式將細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，無細(xì)胞的培養(yǎng)廢液被轉(zhuǎn)移出去，同時(shí)注入同樣體積的新鮮培養(yǎng)基.細(xì)胞則加以循環(huán)利用，這種培養(yǎng)方式稱為細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng).一般通過沉降、離心和膜過濾3種方式進(jìn)行.

該培養(yǎng)方式一般可用于食品工業(yè)中為牛奶、酸奶培養(yǎng)乳桿菌等，Sung等[20]用帶有陶瓷過濾裝置的發(fā)酵罐培養(yǎng)乳酸細(xì)菌檸檬明串珠菌，獲得了OD660為75的菌體密度，高出分批培養(yǎng)約6倍，培養(yǎng)周期延長至105 h.除此之外，也有人將細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)方式應(yīng)用于活細(xì)胞的培養(yǎng)，如Kang等[21]采用細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)方式培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌孢子，獲得了濃度為82.2 g/L的菌體生物量，較分批培養(yǎng)高出4倍，孢子含量在95%以上.

3.3 補(bǔ)料分批培養(yǎng)

以上2種培養(yǎng)方式都是采用補(bǔ)料策略，主要原則都是將代謝廢物以不同的方式轉(zhuǎn)移出去，消除其抑制作用，同時(shí)不斷補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液，為微生物提供充足的養(yǎng)分，使細(xì)胞達(dá)到較高密度.

補(bǔ)料分批培養(yǎng)[22]就是通常所說的流加培養(yǎng)，它是根據(jù)菌體實(shí)時(shí)生長情況和培養(yǎng)基特點(diǎn)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)補(bǔ)加新鮮營養(yǎng)液速度[23]，防止?fàn)I養(yǎng)過剩給細(xì)胞生長帶來抑制作用，使菌體生長及其目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)的時(shí)間最大限度延長，數(shù)量最大限度增多.文獻(xiàn)[24]研究發(fā)現(xiàn)，首先采用較稀的麥芽汁培養(yǎng)酵母菌，中途補(bǔ)充幾次新鮮培養(yǎng)液，可以提高酵母產(chǎn)量，減少乙醇積累，這是最原始的補(bǔ)料技術(shù).如今技術(shù)逐漸發(fā)展，應(yīng)用日益深入，補(bǔ)料方式也得到了不斷改進(jìn)和豐富.其補(bǔ)料控制類型主要包括反饋控制和非反饋控制2種.反饋控制法是基于生理模型的，通過控制培養(yǎng)過程中菌體濃度、底物濃度、pH值、溶解氧濃度和CO2釋放速率等生理參數(shù)來實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)補(bǔ)料調(diào)節(jié)，但是根據(jù)微生物生長狀況的反饋需要一定時(shí)間，對(duì)營養(yǎng)物流加控制具有一定的滯后性，因此培養(yǎng)過程中有可能會(huì)出現(xiàn)糖濃度的不穩(wěn)定波動(dòng)或者有害物質(zhì)的積累.而非反饋控制策略是基于動(dòng)力學(xué)模型的，設(shè)定固定參數(shù)按動(dòng)力學(xué)模型流加培養(yǎng)液，常用的動(dòng)力學(xué)模型主要有恒速流加、變速流加、間歇流加和指數(shù)流加.

補(bǔ)料分批培養(yǎng)不僅能為微生物提供充足的養(yǎng)分，以維持細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成處于最優(yōu)化狀態(tài)，進(jìn)而使培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到較高水平，而且能有效解除高濃度底物或代謝物的抑制作用，延長生產(chǎn)時(shí)間.比如酵母工業(yè)研究中，段學(xué)輝等[25]比較了普通分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)對(duì)酒精酵母細(xì)胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)料分批培養(yǎng)不僅有利于酒精酵母的快速生長，得到較高的菌體濃度，而且酵母的有效重復(fù)利用次數(shù)達(dá)4批次，培養(yǎng)44 h后，菌體濃度達(dá)到了71.82 g DCW/L，比分批培養(yǎng)提高了155.68%.

補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中必須要確定最佳的補(bǔ)料策略[26]，即找出最佳的培養(yǎng)條件和最合適的補(bǔ)料方式，使菌體生長和產(chǎn)物產(chǎn)生始終處于最佳狀態(tài).補(bǔ)料策略的理論依據(jù)主要有格林原理、龐特里金最小值或最大值原理等，加上計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅猛發(fā)展，也為補(bǔ)料分批培養(yǎng)的監(jiān)測與控制提供了更精準(zhǔn)有效的手段.

目前補(bǔ)料分批培養(yǎng)的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)廣泛，成功應(yīng)用于高效生產(chǎn)有機(jī)酸、抗生素、維生素、氨基酸、酶制劑及生長激素等.如，分批培養(yǎng)高山被孢霉高產(chǎn)花生四烯酸需要很長的發(fā)酵時(shí)間，因?yàn)榇司w生長速率較慢，生長周期大約為7 d，Xiao-Jun Ji等用分批補(bǔ)料培養(yǎng)策略將其周期縮短至5 d，花生四烯酸產(chǎn)量由0.9 g/（L·d）增加至 1.3 g/（L·d）[27].

4 結(jié)束語

我國發(fā)酵行業(yè)多數(shù)產(chǎn)品的技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)都處于較低的水平，存在著產(chǎn)品分離純化技術(shù)落后，高質(zhì)量產(chǎn)品產(chǎn)量低、資源浪費(fèi)、環(huán)境污染、成本高、代價(jià)大等問題.高效的培養(yǎng)技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)為解決這些問題提供了可能性.高密度發(fā)酵技術(shù)既是生產(chǎn)高質(zhì)量、高密度菌體和代謝產(chǎn)物的首要環(huán)節(jié)，也是菌體和代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的有力支撐，現(xiàn)已經(jīng)逐漸成為了生化工程重要研究領(lǐng)域.而著重于研究優(yōu)化微生物高密度培養(yǎng)的限制性條件，并且將高密度培養(yǎng)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室水平推廣到工業(yè)化領(lǐng)域，從工程菌的培養(yǎng)推廣至非工程菌的培養(yǎng)，這將是今后研究的重點(diǎn).

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