鐘阿紅，張振宇(綜述)，余進(jìn)進(jìn)，吳亦波(審校)

(1.蘇州大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇無(wú)錫214062;2.江南大學(xué)附屬醫(yī)院無(wú)錫市第四人民醫(yī)院a.婦產(chǎn)科，b.生殖中心，江蘇 無(wú)錫214062)

微RNA(microRNA，miRNA)是一類由21～23個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA，通過(guò)完全或不完全堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與特定基因的信使RNA的3'-非翻譯區(qū)或5'-非翻譯區(qū)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)對(duì)靶信使RNA降解或抑制翻譯過(guò)程而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。1993年，Lee等［1］通過(guò)對(duì)秀麗新小桿線蟲(chóng)的研究首先報(bào)道了miRNA的存在。2000年，Reinhart等［2］在線蟲(chóng)發(fā)育調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)了第2個(gè)miRNA——let-7，從而拉開(kāi)了對(duì)miRNA研究的序幕。自miRNA被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)萬(wàn)種miRNA，這一數(shù)字仍在不斷增加。相信隨著科學(xué)的進(jìn)步，技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的未知miRNA將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)也將會(huì)面臨新的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)就miRNA的特征及研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 miRNA簡(jiǎn)介

1.1 miRNA的命名 Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase)是一個(gè)提供包含miRNA的序列數(shù)據(jù)、miRNA的命名以及對(duì)miRNA靶基因預(yù)測(cè)的全方位數(shù)據(jù)庫(kù)。作為存儲(chǔ)miRNA信息的權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)，miRBase具有對(duì)miRNA基因名稱獨(dú)立注冊(cè)的權(quán)利。早在miRNA被大規(guī)模發(fā)現(xiàn)的時(shí)候，其命名機(jī)制就被確定下來(lái)，當(dāng)前已發(fā)展了一套成熟的miRNA命名系統(tǒng)［3］。目前，miRBase已于2014年6月升級(jí)至miRBase 21.0版。在該版本中，共收錄28 645個(gè)miRNA前體和35 828個(gè)成熟體miRNAs，涵蓋了223個(gè)物種。相比上一版本(miRBase 20.0版)，新版數(shù)據(jù)庫(kù)的可靠性進(jìn)一步提升，清除了一些不明確的和錯(cuò)誤注釋的序列，又有72個(gè)條目被清理出數(shù)據(jù)庫(kù)。miRNA的命名一般遵循以下基本規(guī)則:(1)miRNA的成熟體通常用miR表示，而miRNA的前體則用mir表示，然后是其物種名稱(采用3～4個(gè)字母的縮寫(xiě)來(lái)表示)以及被發(fā)現(xiàn)的時(shí)間次序(一般使用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，如hsa-miR-200，mmu-miR-200);(2)同源性較高的miRNA在數(shù)字后面加上英文小寫(xiě)字母(a，b，c，…)，如 hsa-miR-200a、hsa-miR-200b 和has-miR-200c;(3)如果一個(gè)成熟的miRNA不是由同一條染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)生，則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)別(如hsa-miR-16-1和hsa-miR-16-2);(4)若一個(gè)miRNA前體的兩個(gè)臂可以分別轉(zhuǎn)錄加工成 miRNA，則用“-5p”和“-3p”以區(qū)分，分別表示從該前體的5'端臂和3'端臂加工而來(lái)(如 hsa-miR-125a-5p和 has-miR-125a-3p)［3］。以前認(rèn)為，這兩個(gè)miRNA表達(dá)水平有差異，將表達(dá)水平較低的miRNA在后面加上*號(hào)表示，而表達(dá)水平較高的miRNA后面則不加任何符號(hào)。并且一般認(rèn)為miRNA*是沒(méi)有功能的，但是有研究報(bào)道m(xù)iRNA*其實(shí)也是有功能的［4］，在某些組織里表達(dá)水平甚至高于miRNA［5］。自miRBase19.0版起，這種 miRNA*命名方式已經(jīng)終止使用。另外，命名規(guī)則確定之前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的miRNA，如lin-4和let-7，則仍使用原來(lái)的名字。

1.2 miRNA的生物合成 miRNA的生物合成是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，它具有多個(gè)步驟。首先，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄為初級(jí)miRNA;隨后，經(jīng)Drosha-DGCR(Drosha-DiGeorge syndrome critical region gene)8復(fù)合物的幫助，初級(jí)miRNA被剪接成長(zhǎng)為70～80 nt的具有類似發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的miRNA前體;接著，在核質(zhì)(細(xì)胞質(zhì))轉(zhuǎn)運(yùn)輸出蛋白5的參與作用下，miRNA前體被自細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中;然后，經(jīng)核酸酶Dicer作用，miRNA前體被進(jìn)一步剪切成長(zhǎng)度約為22 nt的雙鏈RNA分子;最后，雙鏈RNA分子在解旋酶的酶解作用下，一條鏈被降解，另一條鏈則成為成熟的miRNA，并與Argonaute蛋白一起，與特異的RNA沉默復(fù)合物結(jié)合后形成特異的RNA沉默復(fù)合物-信使RNA復(fù)合物，再按照堿基互補(bǔ)原則與靶信使RNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮相關(guān)負(fù)性調(diào)控作用。

1.3 miRNA的生物特性

1.3.1 高度的進(jìn)化保守性 目前研究認(rèn)為，成熟的miRNA在物種進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性，人們?cè)诘偷壬锖透叩壬锘蚪M中均可以找到同源miRNA，如人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的miRNA之間就有40%的同源基因［6］。miRNA序列結(jié)構(gòu)上的這種高度保守性具有重要的生物學(xué)意義，提示可能在不同生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，miRNA具有比較一致的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，同時(shí)這也為生物進(jìn)化的同源性提供了某種依據(jù)，對(duì)人們了解物種演變的過(guò)程具有非常重要的意義。

1.3.2 表達(dá)的空間特異性 miRNA只在特定的細(xì)胞或組織表達(dá)，如miR-124和miR-9在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá)，但是兩者仍有區(qū)別，miR-124主要表達(dá)于神經(jīng)前體細(xì)胞中，而miR-9則主要表達(dá)于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中［7-10］。miRNA在不同組織間、細(xì)胞間的差異表達(dá)，向人們提示miRNA可能在生物體的組織或細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮了作用，也對(duì)人們理解生物體在正常和疾病狀態(tài)下miRNA表達(dá)的形式和水平的不同有一定的幫助。

1.3.3 表達(dá)的時(shí)間特異性 miRNA只在特定的時(shí)間或發(fā)育階段表達(dá)。如miR-1和let-7能在成年果蠅中表達(dá)，而未能在培養(yǎng)20～24 h的果蠅胚胎細(xì)胞中檢測(cè)到［3］。miRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出時(shí)間發(fā)育特異性，提示miRNA可能參與了生物體個(gè)體的發(fā)育過(guò)程，并且極有可能在其中發(fā)揮了調(diào)控作用。

1.4 miRNA的功能 miRNA通常位于基因間隔區(qū)，但也有部分存在于遺傳編碼基因的內(nèi)含子中［11］。它雖僅占人類基因總數(shù)的2%，卻調(diào)控著人類基因組中30%以上的基因，是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分［12］。miRNA在生物體內(nèi)廣泛存在，對(duì)包括生物體的細(xì)胞增殖、分化、凋亡和生物體個(gè)體的發(fā)育以及疾病的產(chǎn)生、進(jìn)展及預(yù)后等生命活動(dòng)均發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)調(diào)控作用，故而對(duì)其進(jìn)行深入研究具有非常重要的意義［13-14］。當(dāng)今，miRNA已成為腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。Calin等［15］于2002年最先報(bào)道了miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)基因組的不穩(wěn)定性是腫瘤的常見(jiàn)特征之一，約50%的miRNA基因位于與腫瘤相關(guān)的染色體的脆性位點(diǎn)上，而且不同類型的腫瘤具有明顯不同的miRNA表達(dá)譜［16］。miRNA具有類似癌基因或抑癌基因的功能，表現(xiàn)為癌基因的活化或抑癌基因的失活，如 Let-7、miR-15、miR-16、miR-34a/b/c、miR-124、miR-143、miR-145、miR-122a等在多種腫瘤中相繼被證實(shí)發(fā)揮類似抑癌基因的作用［17-22］，而 miR-21、miR-10b、miR-221 和 miR-222 等在多種腫瘤中扮演著類似癌基因的角色［23-26］。

1.5 miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 由于miRNA的功能與其所調(diào)控的靶基因密切相關(guān)，所以研究miRNA的功能必將涉及對(duì)miRNA靶基因的鑒定。但是，miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)通常并不是一一對(duì)應(yīng)的，大多數(shù)情況下，一個(gè)miRNA同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因發(fā)揮調(diào)控作用，而一個(gè)基因也同時(shí)被多個(gè)miRNA所調(diào)控;況且生物體具有非常復(fù)雜的內(nèi)在機(jī)制，miRNA的表達(dá)調(diào)控并不是孤立存在的，miRNA對(duì)基因的調(diào)節(jié)存在著多種調(diào)控機(jī)制和作用模式，所以，鑒定miRNA靶基因既是這一研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，也是該研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。生物信息學(xué)的飛速發(fā)展使科學(xué)家們能夠使用特殊的軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因［27］。生物信息學(xué)方法主要是基于miRNA和靶基因間的相互作用具有一定的規(guī)律性，通過(guò)建立計(jì)算模型，整合已有的生物學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)用某種算法或程序來(lái)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。目前常規(guī)的算法和程序一般遵循以下幾條規(guī)律:①miRNA靶位點(diǎn)在不同物種之間具有保守性;②miRNA與靶基因之間具有互補(bǔ)性;③miRNA與信使RNA相互之間具有熱穩(wěn)定性;④miRNA5'端的結(jié)合能力比3'端的結(jié)合能力強(qiáng)［28］。除了以上這些基本規(guī)則外，不同的算法和程序還會(huì)根據(jù)各自總結(jié)的規(guī)律進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)方法的應(yīng)用前景廣闊，使尋找miRNA靶基因有律可循，但是這種方法得出的結(jié)果假陽(yáng)性率很高;并且運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miRNA與信使RNA相互作用只是一種理論上的結(jié)合，在不同條件下，miRNA究竟以何種作用形式以及水平存在并不能通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站主要包括，①TargetScan:科學(xué)家在2003年開(kāi)發(fā)的一款用于預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物miRNA靶基因的軟件，它主要是基于miRNA與信使RNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，利用miRNA結(jié)構(gòu)序列上的保守性和信使RNA與miRNA相互之間的熱力學(xué)穩(wěn)定性，來(lái)預(yù)測(cè)miRNA靶目標(biāo)，它為人們提供網(wǎng)絡(luò)實(shí)時(shí)服務(wù)，是目前使用頻率最高的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件;②miRbase:該軟件可以通過(guò)名稱、關(guān)鍵詞或序列等方式進(jìn)行檢索，并可通過(guò)鏈接查詢有關(guān)該miRNA的主要文獻(xiàn)，對(duì)miRNA進(jìn)行基因組背景分析及靶標(biāo)預(yù)測(cè)等;③miRanda:是第一個(gè)利用生物信息學(xué)對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)的軟件，于2003年開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)，應(yīng)用范圍廣，但假陽(yáng)性率較高;④PicTar:是研究人員通過(guò)特定的計(jì)算法則來(lái)預(yù)測(cè)脊椎動(dòng)物、線蟲(chóng)、果蠅和人類的非保守但共表達(dá)的miRNA的靶基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 miRNA的靶基因驗(yàn)證 雖然運(yùn)用生物信息學(xué)的方法可以為研究人員提供大量的信息，且相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，但是，它只是通過(guò)理論上的某種計(jì)算為研究人員提供某些參考信息，存在一定的局限性和可靠性，還需要通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。最直接的驗(yàn)證方法是，運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA后的細(xì)胞(組織)中信使RNA水平及蛋白水平，從而明確miRNA與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。近年來(lái)發(fā)展快速的熒光素酶報(bào)告基因法由于其快速、靈敏度高以及檢測(cè)范圍廣，可以直接驗(yàn)證miRNA的靶位點(diǎn)。

1.7 miRNA的檢測(cè) 目前已有多種方法檢測(cè)miRNA，包括基因克隆、Northern blotting、原位雜交、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、微陣列芯片及高通量測(cè)序等技術(shù)。目前，大多數(shù)miRNA是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄克隆識(shí)別和鑒定出來(lái)的，這是人們發(fā)現(xiàn)miRNA的一個(gè)重要方法;Northern blotting是最為經(jīng)典的檢測(cè)RNA的手段，也是目前檢測(cè)miRNA表達(dá)水平的最主要方法，所有通過(guò)克隆和生物信息學(xué)分析得來(lái)的miRNA都應(yīng)該經(jīng)過(guò)Northern blotting來(lái)驗(yàn)證和鑒定;原位雜交是了解miRNA時(shí)間和組織特異性表達(dá)最常用的方法;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)是一種可以定量分析miRNA表達(dá)水平的方式，也可用于驗(yàn)證生物學(xué)預(yù)測(cè)的miRNA;芯片技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了在全基因組水平鑒定成熟miRNA的表達(dá)，分析同一細(xì)胞中不同的miRNA的差異性表達(dá)以及比較不同組織或細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜的差異，成為高通量檢測(cè)的最佳選擇;高通量測(cè)序能夠在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA，成功地檢測(cè)到了基因芯片未發(fā)現(xiàn)的miRNA［29］。

2 miRNA的應(yīng)用

由于miRNA在生命活動(dòng)中表現(xiàn)出來(lái)的廣泛調(diào)節(jié)功能以及對(duì)基因表達(dá)、生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展等的復(fù)雜效應(yīng)，miRNA自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)即成為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。生命科學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代，利用miRNA從分子水平來(lái)闡明生物體的生命活動(dòng)過(guò)程，闡述物種的起源和生物的演化，來(lái)揭示生命的奧秘?；虮磉_(dá)具有時(shí)間和空間的特異性，不同物種、組織、細(xì)胞，在不同生理、病理狀態(tài)下miRNA的表達(dá)情況不同，它們可能會(huì)成為用于診斷和(或)區(qū)分健康與疾病狀態(tài)的潛在生物標(biāo)志物［30］。目前，miRNA已經(jīng)作為多種疾病的生物標(biāo)志物［31-33］。此外，理論上，通過(guò)改變miRNA的空間結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點(diǎn);抑或采用miRNA模擬物、miRNA激動(dòng)劑、miRNA抑制物以增加或降低病變組織或細(xì)胞的miRNA水平，從而下調(diào)或上調(diào)特異性靶蛋白的表達(dá)，開(kāi)展基于miRNA的分子靶向治療及個(gè)體化治療方案［34］。

3 小結(jié)

在過(guò)去的研究中，人們已經(jīng)了解了很多關(guān)于miRNA的特性及功能的知識(shí)，但對(duì)miRNA具有的所有特性和功能還缺乏全面的研究;而miRNA在生物體整體分子網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色的研究才剛剛開(kāi)始。在未來(lái)的研究中，人們將會(huì)運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)方法來(lái)研究miRNA參與控制生物體的生長(zhǎng)發(fā)育以及生物體在不同狀態(tài)下的表達(dá)水平，對(duì)生物體的生命機(jī)制進(jìn)行全面而系統(tǒng)地分析。相信隨著研究的不斷深入，這些研究成果必將會(huì)造福于人類。

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