李 勇 （寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系 寧夏 銀川 750021） 張玉玲 （寧夏動物疾病預(yù)防控制中心 寧夏 銀川） 魏彥明 （甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 甘肅 蘭州）

試驗研究

披針葉黃華堿對細胞免疫功能的影響

李 勇 （寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系 寧夏 銀川 750021） 張玉玲 （寧夏動物疾病預(yù)防控制中心 寧夏 銀川） 魏彥明 （甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 甘肅 蘭州）

為研究披針葉黃華堿對小鼠細胞免疫功能的影響。取80只小鼠，按灌服劑量為6、13、25mg/kg，共分 3個試驗組和1個蒸餾水對照組(0.5ml/d)，連續(xù)給藥20d，觀察披針葉黃華堿對小鼠體重、臟器質(zhì)量、臟器指數(shù)、巨噬細胞吞噬能力及T淋巴細胞數(shù)量的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，灌服3個不同濃度披針葉黃華堿后小鼠體重、臟器質(zhì)量、臟器指數(shù)、巨噬細胞的吞噬能力及T淋巴細胞數(shù)量均有所降低。在本試驗條件下，中高濃度的披針葉黃華堿對小鼠的免疫功能有抑制作用。

披針葉黃華堿 小鼠 細胞免疫功能

1 材料與方法

1.1 材料 （1）設(shè)備儀器：ARll40/C型電子分析天平，奧毫斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；HWlA型電熱恒溫水溫箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠；H-600型透射電子顯微鏡，日本日立產(chǎn)；冰箱、微量移液器、小鼠灌胃器、小動物解剖器械等其他設(shè)備與器材，均由寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室提供。（2）主要藥品與試劑：濃鹽酸、亞硝酸鈉、甲醛、(西安藍翔化工有限公司生產(chǎn))；甲基綠(上海化學(xué)試劑廠生產(chǎn))；副品紅(天津市天新精細化工開發(fā)中心生產(chǎn))；披針葉黃華堿由寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室提供；醋酸-A萘酯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；乙二醇單甲醚(上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法 （1）分組及給藥。20日齡ICR小鼠，體重18～22g，雌雄各半，共80只；體重2kg左右的公雞2只。以上試驗動物均購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。將小鼠隨機分成4組，每組10只。試驗前測得所用披針葉黃華堿的LD50=127.04 mg/kg，按照LD50的1/20、1/10、1/5設(shè)低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組給藥量分別為6、13、25mg/kg，并設(shè)飼喂蒸餾水為對照組(0.5ml/d)[4]。每天按以上劑量灌胃給藥，連續(xù)20d。飼喂期間各組給予充足的飼料和飲水。（2）披針葉黃華堿對小鼠體重和主要臟器指數(shù)的影響。小鼠末次灌胃2h后，稱量體重，摘除眼球放血，頸椎脫臼處死，剪取實質(zhì)性臟器，分別稱重，按以下公式計算各臟器指數(shù)：臟器指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100%。（3）披針葉黃華堿對小鼠巨噬細胞吞噬機能的影響。每只小鼠腹腔注射10%淀粉肉湯0.5ml后輕揉腹部。5d后每只小鼠再腹腔注射1%雞紅細胞懸濁液0.5ml后輕揉腹腔。60min后，適量抽取小鼠腹腔液，并制成推片，在37℃恒溫箱內(nèi)干燥，用瑞氏染色液染色后，在油鏡下觀察計數(shù)每100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)和每個巨噬細胞吞噬的雞紅細胞數(shù)，按照下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)[5-7]。吞噬百分率(%)=(100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/100個巨噬細胞)×100%。吞噬指數(shù)=100個巨噬細胞中被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/100個巨噬細胞。（4）披針葉黃華堿對小鼠血液中T淋巴細胞數(shù)量的影響。采用酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色法標(biāo)記小鼠外周血液中T淋巴細胞并計數(shù)[8]。摘除小鼠眼球后，取眶靜脈血液制成血涂片。將血涂片在4℃甲醛-丙酮緩沖固定液中固定10min，蒸餾水沖洗3次；放入孵育液中，37℃恒溫箱中孵育3h；用蒸餾水沖洗3次；放入2%甲基綠水溶液復(fù)染細胞核5min；用各級丙酮迅速脫水，二甲苯透明，最后用樹膠封片[9]。酯酶染色陽性細胞即T淋巴細胞形態(tài)為圓形、胞質(zhì)少，胞核為綠色、圓形，胞質(zhì)邊緣及其他部位有1到多個粗大的紅色或棕紅色顆粒。酯酶染色陰性細胞(其他的淋巴細胞)形態(tài)也

如上述，但胞質(zhì)里無著色的顆粒[10]。顯微鏡觀察并記數(shù)100個淋巴細胞中ANAE陽性細胞的數(shù)量，按下式計算T淋巴細胞百分比：T淋巴細胞百分比=(ANAE陽性細胞/100個淋巴細胞) ×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用DPS3.01統(tǒng)計軟件進行方差分析和Duncan新復(fù)極差法多重比較，數(shù)據(jù)用±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 披針葉黃華堿對小鼠質(zhì)量以及主要臟器指數(shù)的影響（1）由表1可知，灌服不同劑量的披針葉黃華堿20d后，各組小鼠的平均體重均有所下降，呈現(xiàn)出隨灌服劑量增加而下降的趨勢。與對照組相比較，低劑量組小鼠體重下降不明顯(P>0.05)，而中劑量組和高劑量組小鼠體重明顯下降(P<0.05)。（2）表2、3可知，灌服不同劑量的披針葉黃華堿20d后，均可使小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺各主要臟器重量和臟器指數(shù)降低。中劑量組和高劑量組小鼠的器官重量比對照組明顯降低(P<0. 05)，中劑量組和高劑量組的臟器指數(shù)也比對照組明顯降低(P<0. 05)；隨著灌服劑量的增加，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺各主要臟器重量及臟器指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢。

表1 不同濃度披針葉黃華堿對小鼠體重的影響 (g)

表2 不同濃度披針葉黃華堿對小鼠主要臟器重量的影響

表3 不同濃度披針葉黃華堿對小鼠主要臟器指數(shù)的影響

2.2 披針葉黃華堿對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬機能的影響表4可知，在低劑量組中，小鼠腹腔中的巨噬細胞的吞噬百分比明顯高于對照組(P<0.05)，吞噬指數(shù)卻低于對照組(P<0.05)；在中劑量組和高劑量組中，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)都明顯低于對照組(P<0.05)；隨著給藥劑量的增加，吞噬百分比和吞噬指數(shù)都呈降低趨勢。

表4 披針葉黃華堿對小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞吞噬雞紅細胞功能的影響

2.3 披針葉黃華堿對小鼠外周血液中T淋巴細胞數(shù)量的影響 表5可知，在高劑量組中，小鼠外周血液中的T淋巴細胞的數(shù)量與對照組、低劑量組和中劑量組相比，明顯減少(P<0.05)，但對照組、低劑量組和中劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 披針葉黃華堿對小鼠血液中T淋巴細胞數(shù)量的影響

3 討論

3.1 披針葉黃華堿對小鼠體重和主要臟器指數(shù)的影響通過灌服不同劑量的披針葉黃華堿20d后，每個試驗小組中小鼠的平均體重都有下降，隨著生物堿濃度的增加，抑制體重的作用不斷增強。在同一試驗條件下，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺各內(nèi)臟器官的重量也有所下降，同時其臟器指數(shù)也降低，并且呈現(xiàn)出隨著灌服劑量的增加，小鼠各內(nèi)臟器官重量指數(shù)也下降的趨勢。脾臟和胸腺是主要的免疫器官，對機體的免疫力有著重要的影響。在以上試驗條件下，披針葉黃華堿對小鼠脾臟和胸腺的發(fā)育有一定的抑制作用，則說明此類生物堿對動物機體的免疫力有抑制作用。

3.2 披針葉黃華堿對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬機能的影響

本試驗中給小鼠灌服不同濃度的披針葉黃華堿后發(fā)現(xiàn)，除了低劑量組的小鼠外，中等劑量組和高劑量組小鼠腹腔中巨噬細胞的吞噬機能隨灌服的生物堿濃度增加而降低(P<0.05)。而低劑量的生物堿能提高小鼠腹腔中巨噬細胞的吞噬百分比(P<0.05)，但其吞噬指數(shù)卻低于對照組(P<0.05)，說明此濃度的披針葉黃華堿能夠刺激更多的巨噬細胞參與吞噬過程，但同時卻抑制了單個巨噬細胞的吞噬能力。分布于全身大多數(shù)器官組織的巨噬細胞是單核吞噬細胞系統(tǒng)中的重要成員，其吞噬能力在一定程度上可以反映機體的免疫狀態(tài)[11-12]。從整體來看，披針葉黃華堿對小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細胞吞噬能力起到了一定的抑制作用。低濃度的披針葉黃華堿產(chǎn)生的藥理作用提示我們，隨著不斷降低披針葉黃華堿的濃度，其是否既能增加參與吞噬作用的巨噬細胞的數(shù)量，又能提高單個巨噬細胞吞噬的能力，還有待于進一步研究。

3.3 披針葉黃華堿對小鼠外周血液中T淋巴細胞數(shù)量的影響 本試驗中，高劑量組中由于給小鼠灌服的披針葉黃華堿含量大，使得進入小鼠體內(nèi)的生物堿對外周血液中的T淋巴細胞的數(shù)量有顯著的降低作用(P<0.05)，因而對小鼠細胞免疫功能起到抑制作用。低劑量組和中劑量組卻影響不大(P>0.05)。T淋巴細胞主要介導(dǎo)機體的細胞免疫。T淋巴細胞內(nèi)含有ANAE，而區(qū)別血液中T細胞和其他淋巴細胞的方法之一就是ANAE試驗，是一種區(qū)分人類和其他哺乳動物成熟T細胞的測定方法[13-14]。通常情況下，動物體內(nèi)脾臟和胸腺的增重意味著機體淋巴細胞的增殖，淋巴細胞的增殖直接體現(xiàn)免疫應(yīng)答的強弱。試驗中一定濃度的披針葉黃華堿對小鼠脾臟和胸腺的增重有抑制作用，同時也能抑制其外周血液中T淋巴細胞的數(shù)量。因此，可以推測由于披針葉黃華堿能夠抑制T淋巴細

胞的增殖分化和成熟，所以抑制了胸腺和脾臟的生長，最終抑制了細胞免疫的功能。

綜上所述，在本試驗的條件下，中高濃度的披針葉黃華堿對小鼠的細胞免疫功能沒有促進作用，反而有一定的抑制作用。

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S853.75

A

1007-1733(2015)09-0001-03披針葉黃華(Thermopsisl anceolate)異名牧馬豆、土馬豆或野決明，屬豆科野決明屬植物，耐旱性強，廣泛分布于我國干旱和半干旱以及沙漠地區(qū)[1]。據(jù)資料記載本種為有毒植物，動物采食其種子和全草可引起中毒，中毒嚴(yán)重的引起死亡，從而對畜牧業(yè)產(chǎn)生危害。該植物也是有名的藥用植物，具有興奮呼吸，抗輻射、祛痰止咳、抗癌等功效[2]。其所含的生物堿成分還具有一定的增強機體體液免疫力的作用[3]。但目前未見關(guān)于披針葉黃華堿對動物機體細胞免疫功能是否具有促進作用的研究報道。本研究針對披針葉黃華堿是否對小鼠細胞免疫功能產(chǎn)生影響展開研究，為進一步開發(fā)利用披針葉黃華資源提供相關(guān)試驗依據(jù)。

2015–05–27）