許 輝 馬 紅 閔 敏 顧文濤 李遇梅

尖銳濕疣皮損中p16基因啟動子區(qū)高甲基化及其mRNA的表達

許 輝 馬 紅 閔 敏 顧文濤 李遇梅?

目的: 明確尖銳濕疣組織中p16基因啟動子區(qū)高甲基化與p16 mRNA表達的關系。方法:采用甲基化特異性PCR技術檢測30例尖銳濕疣組織及20名正常對照組織p16基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，用RT－PCR法檢測p16 mRNA的表達。結(jié)果: 尖銳濕疣組織p16基因啟動子高甲基化率為26.67%(8/30)，正常對照組高甲基化率為0，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。高甲基化的尖銳濕疣組織p16 mRNA的表達高于未甲基化的尖銳濕疣組織p16 mRNA的表達和高于正常對照組織p16 mRNA的表達。結(jié)論: 尖銳濕疣組織皮損中p16基因啟動子區(qū)甲基化不導致p16 mRNA表達的缺失。

尖銳濕疣； 人乳頭瘤病毒； 甲基化； p16

尖銳濕疣(CA)是由人乳狀瘤病毒感染引起的上皮增生性病變，為重要的性傳播疾病之一。p16基因是參與細胞周期調(diào)控的抑癌基因，主要能與cyclinD競爭性結(jié)合CDK4/6而抑制CDK4/6激酶的活性使pRb不能磷酸化，使未磷酸化的pRb增加而抑制細胞增殖。p16基因失活使p16/pRb調(diào)節(jié)通路異常，致使細胞過度增殖，其主要失活機制有基因突變、純合性缺失和啟動子甲基化。其中啟動子CpG島甲基化是導致p16基因失活的重要原因，是近年來研究的熱點。

國內(nèi)外的研究p16基因在CA患者組織中表達存在異常。因此我們用甲基化特異性PCR技術和RTPCR法檢測30例CA患者組織中p16基因啟動子甲基化異常及其mRNA的表達，研究CA患者中p16基因甲基化的改變及與p16 mRNA表達的關系，以及其在CA發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 30例CA標本均來自江蘇大學附屬醫(yī)院皮膚科2011～2012年新鮮手術切除標本(標本來自肛周及外生殖器部位)，標本離體后，在無菌條件下迅速放入液氮速凍并轉(zhuǎn)至－80℃超低溫冰箱凍存。另選擇20名正常人包皮組織標本用作正常對照。CA患者術前均未接受任何治療，30例組織標本中男20例，女10例，年齡24～60歲，平均36.2±8.3歲。經(jīng)組織病理診斷為CA(圖1)；20名正常對照均為正常包皮組織，無皮炎濕疹等皮膚病。

1.2 組織DNA及RNA提取 把冷凍組織磨碎成粉末狀，放入1.5 mL Ep管中，用組織DNA提取試劑盒(Cat.No 53106，TAKARA公司)及 RNA Trizol(Invitrogen)提取組織DNA及RNA，紫外分光光度計測定純度，A260/A280比值為1.8～1.9，4℃保存。

1.3 甲基化檢測分析

1.3.1 亞硫酸氫鹽修飾按ZYMO RESEARCH公司EZ DNA Methylation－Gold Kit試劑盒進行甲基化修飾。

1.3.2 甲基化特異性PCR擴增 p16基因甲基化引物序列為5′－TTATTAGAGGGTGGGGCG2GATCGC－3和CCCGAACCGCGACCGTAA－3′；非甲基化引物序列為5'－TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT－3′5'－

CAACCCCAAACCACAACCATAA－3′，1分別用于擴增p16基因啟動子區(qū)CpG島甲基化和非甲基化的等位基因；擴增產(chǎn)物長度分別為150 bp和151 bp。PCR反應體系為50 μL，包括1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/ L dNTP，引物各10 pmol，1U Taq DNA聚合酶，50～100 ng模板 DNA。PCR循環(huán)參數(shù):297℃預變性5 min，97℃ 1 min，甲基化和非甲基化擴增的退火溫度分別為65℃和60℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)后，72℃延伸 7 min。PCR擴增時以正常人包皮組織DNA作正常對照，以等量滅菌雙蒸水代替模板DNA作陰性對照。

1.4 實時定量PCR擴增應用Formantas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書操作逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈。按照SYBR Green Pefect Real Time試劑盒(TaKaRa)操作說明書進行PCR擴增。引物序列及反應條件如下，p16:正鏈:GGCACCAGAGGCAGTAACCA，反鏈: GGACCTTCGGTGACTGATGATCTAA，片段長度為120 bp。GAPDH:正鏈:GAAGGTGAAGGTCGGAGCT，反鏈:GAAGATGGTGATGGGATTTC，片段長度為 226 bp。擴增曲線反應條件為95℃20 s，1個循環(huán)；95℃5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)；溶解曲線反應條件為95℃ 30 s，56℃ 1 min，95℃ 30 s?？偡磻w積為20 μL，擴增產(chǎn)物在MX3000P儀上分析。

1.5 結(jié)果分析 DNA PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色觀察。RT－PCR產(chǎn)物根據(jù)所得的Ct值，利用公式2－ΔCt得到目的基因的定量值。

1.6 統(tǒng)計學方法 根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇卡方檢驗和t檢驗，所有數(shù)據(jù)均在SPSS 15.0軟件包中進行分析。

2 結(jié)果

2.1 p16基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀況 以亞硫酸氫鈉修飾后的基因組DNA為模板，用PCR對p16基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化進行檢測，甲基化和非甲基化擴增產(chǎn)物分別為150 bp和151 bp(圖2)。結(jié)果表明30例CA組織中有8例高甲基化(8/30，26.67%)，正常對照組均未見高甲基化。CA p16基因高甲基化率高于正常對照組(χ2＝4.52，P＜0.05，表1)。

2.2 p16 mRNA的表達 30例CA中22例非高甲基化患者p16 mRNA表達0.95±0.06高于20例正常對照0.68±0.10，P＜0.05，8例高甲基化患者中p16 mRNA的表達1.08±0.09明顯高于于正常對照組0.68± 0.10，P＜0.01和未甲基化組0.95±0.06，P＜0.05，表2。

2.3 p16基因啟動子高甲基化與p16 mRNA表達的關系 30例CA組織中有8例(8/30，26.67%)存在基因啟動子高甲基化，22例未甲基化，30例CA組織中均沒有p16 mRNA的失表達。p16基因高甲基化未導致p16 mRNA表達的缺失。

表1 CA組和正常對照組甲基化率的比較

表2 CA組和正常對照組p16 mRNA表達水平

3 討論

p16基因定位于人9號染色體短臂2區(qū)1帶(9P21)，能抑制細胞分裂、增殖。以往研究已證實，HPV感染皮膚黏膜后產(chǎn)生早期蛋白E7，它與宿主細胞的Rb相結(jié)合，導致Rb基因功能失活，失去對p16的負反饋抑制，致使p16蛋白過度表達。1本實驗30例CA中22例非高甲基化患者p16 mRNA表達高于20名正常對照，8例高甲基化患者中p16 mRNA的表達也明顯高于于正常對照組，與以往的研究結(jié)果一致。2

甲基化是指DNA在甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTS)催化下，由S腺苷蛋氨酸提供甲基，胞嘧啶的5’位碳上加上一個甲基基團，形成5’位胞嘧啶(5’MC)，是除缺失與突變之外的另一種調(diào)控基因表達的機制。p16基因是甲基化的靶基因。相當數(shù)量的報道發(fā)現(xiàn)肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌患

者中都存在p16基因的甲基化狀態(tài)異常。也有研究表明p16甲基化狀態(tài)與某些腫瘤，如卵巢癌，惡性間皮瘤的預后有關。李遇梅，崔盤根等的實驗結(jié)果表明SLE患者p16基因呈高甲基化狀態(tài)。3，4夏永華等的研究發(fā)現(xiàn)p16啟動子甲基化與銀屑病角質(zhì)形成細胞過度增殖有關，且與病期有關。5有些研究報道p16基因啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)與p16蛋白表達呈明顯負相關。6，7而在脂肪肉瘤8及巴雷特氏食管以及食管腺癌9的研究中發(fā)現(xiàn)，p16的高甲基化與p16 mRNA的表達水平無明顯的相關性。我們通過甲基化特異性PCR研究表明，30例 CA患者中，甲基化陽性率26.67%(8/30)，非甲基化率73.33%(22/30)，較正常對照組有統(tǒng)計學差異。故推測CA患者組織中存在p16基因啟動子區(qū)的高甲基化。而本實驗也檢測了p16 mRNA的表達，但結(jié)果顯示p16 mRNA的表達增高，與DNA高甲基化之間無負相關性。因此我們推測CA患者中存在p16啟動子區(qū)高甲基化，但是一方面HPV E7與Rb結(jié)合失去了對p16的負反饋抑制，另一方面由于遺傳以及表觀修飾學的不穩(wěn)定，CA患者組織皮損中p16基因啟動子區(qū)高甲基化不影響p16的表達。

CA是生殖道常見的性傳播疾病，發(fā)病有增加趨勢，目前已成為發(fā)病率第二的性傳播疾病。CA多為低危型HPV感染，與HPV6、11型關系尤為密切。但部分感染低危型HPV的CA仍有發(fā)生癌變的可能。10在HPV相關的宮頸癌和其它生殖道疾病的研究中報道p16蛋白過表達與其基因突變和重排的關系不大，但與p16基因CPG島異常甲基化有密切關系，甲基化是宮頸癌發(fā)生的早發(fā)事件。Kim等發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變進展p16甲基化率與p16陽性表達率均升高。11本實驗發(fā)現(xiàn)30例CA組織中有8例高甲基化，并且這8例高甲基化患者中p16 mRNA的表達明顯高于正常對照組，這8例p16高甲基化的CA患者疾病的發(fā)展轉(zhuǎn)歸還需要進一步隨訪及觀察。

1 Nieh S，Chen SF，Chu TY，et al.Is p16(INK4A)expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undertermined significancecategorized Pap Smear?A comparative analysis using abnomal cervical smears with follow－up biopsies.Gynecol Oncol，2005，97:35－40.

2李亞婷，王克玉.尖銳濕疣組織及鄰近組織中P16和Ki－67的表達.中國麻風皮膚病雜志，2009，25(8):573－575.

3李遇梅，李安生，姚煦，等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者DNA p16基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài).中華皮膚科雜志，2005，38(7): 419－422.

4崔盤根，季江.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單一核細胞及中性粒細胞p16基因甲基化狀態(tài)研究.臨床皮膚科雜志，2005，34(12):804－806.

5夏永華，李紅文，丁一.銀屑病角質(zhì)形成細胞p16啟動子甲基化的研究.中華皮膚科雜志，2006，39(3):128－130.

6 Abbaszadegan MR，Moaven O，Sima HR，et al.p16 promoter hypermethylation:a useful serum marker for early detection of gastric cancer.World J Gastroenterol，2008，14(13):2055－2060.

7 Ishikawa A，Sasaki M，Sato Y，et al.Frequent p16 inactivation is an early and frequent event of intraductal papillary neoplasm of the liver arising in hepatolithiasis.Human Pathology，2004，35 (12):1505－1514.

8 He M，Aisner S，Benevenia J，et al.Epigenetic alteration of p16 gene in dedifferentiation of liposarcoma.Pathol Res Pract，2009，205(6):386－394.

9 Hardie LJ，Darnton SJ，Wallis YL，et al.p16 expression in Barrett’s esophagus and esophageal adenocarcinoma:association with genetic and epigenetic alterations.Cancer Letters，2005，217 (2):221－230.

10 Nemes JA，Deli L，Nemes Z，et al.Expression of p16，p53，and Rb proteins are independent from the presence of human papillomavirus genes in oral squamous cell carcinoma.Oral Surg Dral Med Oral Pothol Oral Radiol Endocl，2006，102:344－352.

11 Serrno M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell－cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature，1993，366:704－707.

(收稿:2013－04－23 修回:2013－05－28)

The hypermethylation of p16 gene promoter region and the expression of p16 mRNA in condyloma accuminatum

XU Hui，MA Hong，MIN Min，et al.The Affiliated Hospital of Jiang Su University，Zhenjiang，212000

Objective:To determine the relationship between the hypermethylation of the p16 gene promoter region and the expression of p16 mRNA in condyloma accuminatum(CA)tissue.Methods:The hypermethylation of p16 gene promoter CpG island and the expression of p16 mRNA were detected by methylationspecific PCR and RT－PCR respectively in CA tissue from 30 patients and 20 healthy controls.Results:The rates of the hypermethylation of p16 gene promoter in CA tissue and normal skin were 26.67%(8/30)and 0，with a significant difference(P＜0.05).The expression of p16 mRNA in hypermethylation CA tissue was higher than that in unmethylated CA tissue and normal tissue.Conclusion:The hypermethylation of p16 gene promoter region does not lead to the loss of p16 mRNA expression in CA tissue.

condyloma accuminatum；HPV；methylation；p16 gene

鎮(zhèn)江市科技局基金資助項目(編號:SH2008040)

江蘇大學附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇鎮(zhèn)江，212000

?通信作者