羅春艷，汪振濤，傅鵬程，樓敏杰，陳玲玲，方旭波′2，袁高峰′2，陳小娥′2′*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 舟山 316022）

響應(yīng)面優(yōu)化魷魚須酶法脫皮工藝及其質(zhì)構(gòu)特性

羅春艷1，汪振濤1，傅鵬程1，樓敏杰1，陳玲玲1，方旭波1′2，袁高峰1′2，陳小娥1′2′*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 舟山 316022）

采用不同蛋白酶進行魷魚須脫皮實驗，以白度值和原料保留率為指標(biāo)，篩選出最適蛋白酶。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化秘魯魷魚須酶法脫皮工藝參數(shù)，并通過揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、質(zhì)構(gòu)與顯微組織分析樣品的新鮮度及質(zhì)構(gòu)特性。結(jié)果表明，回歸模型能較好反映因素水平與響應(yīng)值的關(guān)系，并確定最適酶法脫皮工藝為胰酶添加量0.25%、料液比17∶20（g/mL）、酶解時間20 min，在此條件下，樣品的白度值為63.95±0.31，原料保留率為（81.22±0.28）%，TVB-N含量為（27.60±0.34） mg/100 g，且質(zhì)構(gòu)特性與肌纖維組織均無顯著變化。脫皮后的秘魯魷魚須TVB-N含量符合GB 2733—2005《鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，色澤鮮亮、肉質(zhì)有彈性、原料保留率高，該工藝適合生產(chǎn)實際需求。

秘魯魷魚須；酶法脫皮；響應(yīng)面；質(zhì)構(gòu)特性

近年來，隨著我國遠洋魷釣的迅速發(fā)展和北太魷魚的減產(chǎn)，低值、捕獲量大的秘魯魷魚（Dosidicus gigas）一躍成為我國主要的遠洋魷釣對象，僅2013年舟山市的秘魯魷魚捕獲量就達10萬 t以上[1-3]。秘魯魷魚個體大、有酸澀味，市場銷售存在困難，必須通過深加工才能實現(xiàn)資源增值[4-6]。目前，國內(nèi)魷魚加工企業(yè)一般只重視秘魯魷魚胴體的加工，而忽視了對魷魚須、耳等可食部位的有效利用，產(chǎn)品附加值低[7-8]。原因主要是秘魯魷魚須表皮厚而深黑，且吸盤很難去除[9]，導(dǎo)致其難以被加工利用。

目前，國內(nèi)魷魚加工企業(yè)采用人工或機械對魷魚酮體進行脫皮。對于魷魚足來說，人工脫皮具有速率慢、吸盤難去除、產(chǎn)率低等缺點，而機械脫皮存在脫皮不完全，需人工二次去除殘余的皮等問題[10-11]。酶法脫皮因其作用條件溫和、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點而備受關(guān)注[12-13]。Raa等[14]報道采用DiZYM蛋白酶在10 ℃以下進行魷魚皮的脫除，魷魚皮脫除效果良好，且魷魚肌肉組織無變化，但DiZYM蛋白酶是從魷魚腸道中提取的，限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。國內(nèi)有關(guān)酶法脫魷魚皮的研究相對較少，如魷魚酮體[11]、魷魚耳[15]和魷魚足[9]酶法脫皮，這些實驗均以感官或白度值為指標(biāo)進行研究，但在實際生產(chǎn)中不僅要考慮色澤與感官指標(biāo)，而且還需考慮產(chǎn)品的得率與質(zhì)構(gòu)。

本研究以白度值和原料保留率為指標(biāo)，比較幾種蛋白酶對秘魯魷魚須的脫皮效果并篩選出最優(yōu)酶，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化酶法脫皮工藝，并對其脫皮前后的樣品新鮮度、質(zhì)構(gòu)特性以及肌纖維組織進行分析，以期獲得較理想的脫皮工藝，旨在提高秘魯魷魚資源利用率，為后續(xù)魷魚須新型產(chǎn)品的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍秘魯魷魚須 浙江正龍食品有限公司；菠蘿蛋白酶（50萬 U/g）、動物蛋白水解酶（20萬 U/g）、中性蛋白酶（20萬 U/g）、胰酶（4 000 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）和木瓜蛋白酶（40萬 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；蘇木精-伊紅染色液（生物染色劑） 上海榕柏生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4型電熱恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BS 110 S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-3B型精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR-10型便攜式色差計 日本柯尼卡美能達公司；TMS-Pro型質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司；YD-202型輪轉(zhuǎn)式切片機 金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；CX 31型三目顯微鏡 日本奧林巴斯公司；KDN-103 F型自動定氮儀 上海纖維儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將冷凍的秘魯魷魚須流水解凍，選取表皮相似的魷魚須，切成10 cm左右的小段，清洗干凈，挑選粗細(xì)相同的進行分類、備用。

1.3.2 酶篩選

以白度值和原料保留率為指標(biāo)，在酶添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）0.2%、料液比1∶2（g/mL）、酶解時間20 min、各自最適pH值與酶解溫度條件下，分別使用菠蘿蛋白酶、動物蛋白水解酶、中性蛋白酶、胰酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶6 種酶對秘魯魷魚須進行酶法脫皮，待酶解結(jié)束后，快速用去離子水沖洗，室溫瀝干，測其白度值和原料保留率。平行實驗3 次。

1.3.3 單因素試驗

在篩選出胰酶的最適溫度45 ℃和pH 7.5條件下，基本酶解條件為料液比1∶2（g/mL）、酶解時間20 min和酶添加量0.2%，以白度值和原料保留率為指標(biāo)，改變1 個因素的水平，其他因素水平不變，考察料液比、酶解時間及酶添加量對秘魯魷魚須脫皮效果的影響。其中料液比為1∶8、1∶4、1∶2、1∶1、2∶1（g/mL），酶解時間為5、10、20、30、40 min，酶添加量為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%。平行實驗3次。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)上述單因素試驗的結(jié)果，選取料液比（A）、酶解時間（B）、酶添加量（C）為試驗因素，以秘魯魷魚須的白度值和原料保留率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，利用軟件Design-Expert V 8.0.6對試驗結(jié)果進行分析，獲得最適酶解條件。

1.3.5 全質(zhì)構(gòu)分析

[16-17]的方法，沿魷魚須軸線切成長寬高約1.5 cm3的立方體魷魚塊，采用TPA模式，選用P/5圓柱形探頭（Φ 5 mm），測前速率5.0 mm/s，測試速率60 mm/min，測后速率5.0 mm/s，壓縮比50%，間隔時間5 s，觸發(fā)力5.0 g。每組樣品測10 次。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察

將魷魚須切成0.2 cm3小塊，用10%中性福爾馬林固定24 h后[18]，按Nuria等[19]方法進行組織結(jié)構(gòu)的觀察。

1.3.7 鮮度指標(biāo)（TVB-N含量）測定

按SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》方法[20]進行測定，每組樣品測3 次。

1.3.8 白度值測定

魷魚須用保鮮袋包實，利用CR-10型色差計測量其L、a、b值，白度值（W）按式（1）計算[21-22]，樣品平行測試10 次。

1.3.9 原料保留率計算

原料保留率表示脫皮后魷魚須的產(chǎn)率，其值越高，表示魷魚須損失越少。

式中：m1為脫皮后魷魚須質(zhì)量/g；m2為脫皮前魷魚須質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用軟件Origin 7.5作圖，通過軟件SPSS 19.0進行結(jié)果統(tǒng)計分析，結(jié)果采用Tukey法檢驗差異顯著性，差異顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的篩選

圖1 幾種蛋白酶對白度值與原料保留率的影響Fig.1 Effect of several enzymes on raw retention rate and whiteness

由圖1可知，木瓜蛋白酶處理的魷魚須白度值最高為63.32而原料保留率卻最低為75.01%，中性蛋白酶處理的魷魚須原料保留率最高為83.17%而白度值卻最低為57.22，而胰酶處理后的魷魚須的白度值和原料保留率分別為62.45和81.85%。因此綜合考慮酶法脫皮后的白度值與原料保留率，最終選擇胰酶為最適酶。

2.2 料液比對脫皮效果的影響

圖2 料液比對白度值和原料保留率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on raw retention rate and whiteness

圖2 表明，在料液比1∶8～1∶1范圍內(nèi)，魷魚須的白度值隨著原料用量的增加而增大，而原料保留率卻逐漸降低。進一步提高原料用量，白度值減小而原料保留率卻升高。因此，考慮到白度值、原料保留率，料液比為1∶2～1∶1比較理想。

2.3 酶解時間對脫皮效果的影響

圖3顯示，隨著酶解時間的延長，白度值逐漸增大而原料保留率卻逐漸降低，其中在30 min內(nèi)，原料保留率在82%～84%范圍內(nèi)，而在40 min后，原料保留率降至79.02%，此時的魷魚須有點硬且具有顏色偏白現(xiàn)象，可能是部分蛋白失水而變性引起其白度值增大和原料保留率降低的原因。因此，酶解時間選擇20～30 min范圍為宜。

圖3 酶解時間對白度值和原料保留率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on whiteness and raw retention rate

2.4 酶添加量對脫皮效果的影響

圖4 酶添加量對白度值和原料保留率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosageon whiteness and raw retention rate

圖4 表明，在酶添加量0.05%～0.4%范圍，白度值隨酶添加量的增加而增大，原料保留率卻降低，當(dāng)酶添加量超過0.4%時，白度值緩慢增大，原料保留率卻開始上升?？赡苁怯捎谠诿缸饔孟率沟敏滛~肌肉組織更易吸水。綜合考慮，酶添加量為0.2%左右。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

以白度值和原料保留率為響應(yīng)值進行優(yōu)化試驗，結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Table1 Experimental design and results of response surface methodology

利用Design-Expert V8.0.6軟件建立響應(yīng)值對自變量編碼值的二次回歸模型方程：W=61.27＋0.71A＋1.46B＋1.55C—0.94AB—0.94AC—1.98BC—0.86A2＋1.08B2—0.50C2；Y=82.96—0.10A—1.68B—1.24C＋0.000AB—0.21AC＋1.03BC＋0.97A2—0.58B2—0.54C2。

表2 回歸模型的方差分析（白度值為響應(yīng)值）Table2 Variance analysis of the regression mode (whiteness as response vaalluuee))

表3 回歸模型的方差分析（原料保留率為響應(yīng)值）Table3 Variance analysis of the regression mode (raw retention rate as response vaalluuee))

為檢驗這兩個模型的有效性，對其進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表2、3?？梢钥闯觯瑑蓚€模型的P=0.000 2和P＜0.000 1，說明這兩個模型高度顯著；失擬項的P=0.902 8＞0.05和P=0.652 3＞0.05，不顯著；對白度值和原料保留率回歸方程檢驗，兩個模型的相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.929 8＞0.9和R2=0.946 8＞0.9，說明模型擬合程度良好；變異系數(shù)分別為0.93%和0.48%，說明兩個模型都能很好地反應(yīng)真實試驗值。因此可用這兩個模型對魷魚須酶法脫皮效果進行分析預(yù)測。

分析這兩個模型各個系數(shù)P值，因素A、B、C、 BC、B2對白度值影響極顯著（P＜0.01），因素A2、AB、AC對白度值影響顯著（P＜0.05）；因素B、C、BC、A2對原料保留率影響極顯著（P＜0.01），因素B2、C2對原料保留率的影響顯著（P＜0.05）；3個因素對酶解脫皮效果的影響順序為：酶添加量（C）＞酶解時間（B）＞料液比（A）。

通過回歸模型繪制試驗因素之間的交互作用的響應(yīng)面圖，如圖5～7所示。結(jié)合模型和響應(yīng)面曲線圖分析獲得秘魯魷魚須酶法脫皮較理想的工藝參數(shù)為：料液比171∶200、酶解時間20 min、酶添加量0.25%。為了實際操作方便，選取料液比17∶20、酶解時間20 min、酶添加量0.25%，在此條件下，進行6次重復(fù)驗證性實驗，得白度值為63.95±0.31、原料保留率為（81.22±0.28）%，與回歸方程所得的白度值64.08和原料保留率81.29%的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.20%和0.09%，說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)有效、可靠，能較好預(yù)測產(chǎn)品的白度值與原料保留率。同時，感官評定表明獲得的魷魚須皮肉完全分離，色澤潔白明亮，肉質(zhì)與原料基本上無差異，滿足消費者的感官要求。

圖5 料液比和酶解時間對白度值和原料保留率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Responsible surface plots for whiteness and raw retention rate affected by solid-to-liquid ratio and hydrolysis times

圖6 料液比和酶添加量對白度值和原料保留率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Responsible surface plots for whiteness and raw retention rate affected by solid-to-liquid ratio and enzyme dosage

圖7 酶解時間和酶添加量對白度值和原料保留率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Responsible surface plots for whiteness and raw retention rate affected by hydrolysis time and enzyme dosage

2.6 鮮度（TVB-N含量）與質(zhì)構(gòu)分析

表4 樣品的TVB-N含量和質(zhì)構(gòu)分析Table4 TVB-N content and textural analysis of control and treated samples

圖8 酶解前后魷魚須肌肉組織切片顯微鏡圖（×200）200Fig.8 Micrographs of muscle slices of control and treated samples (×200)

表4為脫皮前后樣品的鮮度指標(biāo)和質(zhì)構(gòu)特性，在GB 2733—2005《鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[23]中規(guī)定頭足類TVB-N含量不大于30 mg/100 g，表4顯示酶法脫皮會使魷魚鮮度指標(biāo)TVB-N含量顯著升高（P＜0.05），但仍在國標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)，表明獲得的秘魯魷魚須酶法脫皮工藝可行。與脫皮前的樣品相比，脫皮后的魷魚須硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性均有一定的下降，而內(nèi)聚性有微弱的升高，但均無顯著變化（P＞0.05）。圖8為酶解前后的樣品組織石蠟切片，可看出脫皮前后的樣品肌纖維大小均一、形狀規(guī)則、直徑與間距相似，結(jié)構(gòu)均致密而緊湊，兩者無明顯變化，與表4結(jié)果相一致，進一步說明該脫皮工藝條件對魷魚須的質(zhì)構(gòu)影響不顯著。

3 結(jié) 論

本研究以白度值和原料保留率為響應(yīng)值，比較了幾種蛋白酶對秘魯魷魚須的脫皮效果，確定胰酶為優(yōu)選酶。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計進行酶法脫皮工藝優(yōu)化，獲得的模型顯著性高、擬合度好，并獲得較理想的酶法脫皮工藝參數(shù)為：料液比17∶20（g/mL）、酶解時間20 min、加酶量0.25%。此時樣品的白度值和原料保留率分別為63.95±0.31和（81.22±0.28）%，TVB-N含量為（27.60±0.34） mg/100 g且符合GB 2733—2005的規(guī)定，脫皮前后樣品的質(zhì)構(gòu)特性與肌纖維組織均無顯著變化。結(jié)果表明此工藝既能較好的脫去魷魚須的黑皮，又能保持其作為再加工原料的本有特性和較高的原料保留率，能滿足企業(yè)的實際需求。

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Optimization of Enzymatic Deskinning of Squid Tentacles Using Response Surface Methodology and Measurement of Textural Properties

LUO Chunyan1′WANG Zhentao1′FU Pengcheng1′LOU Minjie1′CHEN Lingling1′FANG Xubo1′2′YUAN Gaofeng1′2′CHEN Xiao’e1′2′*
(1. School of Food and Pharmacy Zhejiang Ocean University Zhoushan 316022′China; 2. Joint Key Laboratory of Zhejiang Province for the Research of Fishery Processing Technology Zhoushan 316022′China)

Response surface methodology was used to optimize the enzymatic deskinning parameters for squid tentacles Dosidicus gigas feet were hydrolyzed by various proteases to select the optimum enzyme on the basis of whiteness and raw material retention Combination of single factor method and Box-Behnken design was used to investigate the effects of important hydrolysis parameters on whiteness and raw material retention Total volatile basic nitrogen (TVB-N)′texture and microstructure were measured to compare freshness and textual properties The results indicated that the two regression models developed in this study could better indicate the relationship between factor levels and response values and the optimum conditions for enzymatic deskinning were determined as follows pancreatin dosage′0.25%; solid-to-liquid ratio′17:20 (g/mL); and hydrolysis time′20 minutes Under these conditions whiteness and raw material retention rates were 63.95 ± 0.31 and (81.22 ± 0.28)%′respectively and TVB-N value was (27.60 ± 0.34) mg/100 g with no significant changes observed in textural properties or muscle fiber tissue The TVB-N value of the deskinned sample was in line with the requirement of GB 2733—2005 Hygienic Standard for Fresh and Frozen Marine Products of Animal Origin The sample had bright color and was springy with high raw material retention The process could meet the requirement of actual production.

Dosidicus gigas tentacles enzymatic deskinning response surface methodology texture characteristics

TS254.4

A

1002-6630（2015）06-0029-06

10.7506/spkx1002-6630-201506006

2014-09-12

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310340009）；浙江省自然科學(xué)基金項目（LY12C20006）

羅春艷（1993—），女，本科生，研究方向為水產(chǎn)品加工。E-mail：992351360@qq.com

*通信作者：陳小娥（1968—），女，教授，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用。E-mail：xiaoechen@163.com