黎 睿，謝 剛*，王松雪

（國家糧食局科學研究院，北京 100037）

高效液相色譜法同時檢測糧食中常見8 種真菌毒素的含量

黎 睿，謝 剛*，王松雪

（國家糧食局科學研究院，北京 100037）

建立免疫親和柱凈化-高效液相色譜法同時測定糧食中黃曲霉毒素B1（aflatoxins，AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素的檢測方法。樣品經(jīng)乙腈-水提取后，用免疫親和柱凈化，Agilent Elipse Plus C18（100 mm×4 mm，3.5 μm）色譜柱分離，以甲醇-乙腈-水-乙酸為流動相，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，檢測系統(tǒng)為可變波長檢測器串聯(lián)光化學衍生器串聯(lián)熒光檢測器。根據(jù)信噪比為3的峰響應值，確定各真菌毒素的檢出限為：AFB10.446 ng/mL、AFB20. 152 ng/mL、AFG10.523 ng/mL、AFG20.334 ng/mL、ZEN 7 ng/mL、OTA 0.7 ng/mL、DON 200 ng/mL、T-2毒素100 ng/mL。樣品中各真菌毒素的平均加標回收率，玉米為80.0%～104.5%，小麥為83.2%～102.8%，方法精密度為2.6%～10.2%。從樣品前處理到分析整個過程耗時約2 h。本方法簡便、快速、靈敏度高，適用于糧食中多種真菌毒素的快速測定。

糧食；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2；玉米赤霉烯酮；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；T-2毒素；赭曲霉毒素A；高效液相色譜；免疫親和柱

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，污染糧食的常見真菌毒素包括黃曲霉毒素B1（aflatoxins，AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素等[1-2]。為了保障食品安全，100多個國家/組織頒布了食品及飼料中常見真菌毒素的限量標準，我國也規(guī)定了糧食中AFB1、DON、OTA和ZEN 4種常見真菌毒素的限量值[3]。糧食同時受幾種真菌毒素污染的現(xiàn)象普遍存在[4]，文獻報道的多種真菌毒素同時檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法[5-10]、液相色譜法[11-25]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法需要大型儀器，不適合于基層單位實驗室（縣市級檢測機構(gòu)）的需要；目前國內(nèi)外發(fā)表的液相色譜法最多能同時檢測DON、AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA、ZEN、T-2、HT-2共12 種真菌毒素[17]，該研究其提取、凈化根據(jù)不同極性的真菌毒素采用不同的方法，操作復雜、時間長、成本高；其他同時檢測多種真菌毒素的液相色譜法，在檢測毒素的種類、前處理技術(shù)、回收率、靈敏度等方面依然存在不足，亟需開發(fā)適合我國糧食真菌毒素污染特點的、便于在基層實驗室推廣的、簡便、快速、高效的液相色譜同時檢測方法。

根據(jù)實驗室長期的監(jiān)測數(shù)據(jù)和公開報道的我國糧食中多種真菌毒素同時污染情況，以及我國基層實驗室檢測儀器配置情況，研制了基于免疫親和凈化技術(shù)的同時檢測DON、AFB1、AFG1、AFB2、AFG2、OTA、ZEN和T-2毒素的液相色譜法方法，以解決目前單一毒素檢測方法存在的效率低、耗時長、成本高的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米取自河北灤平某自然村；小麥取自安徽明光某自然村；空白小麥、玉米樣品 實驗室自制；Myco6in1＋免疫親和層析柱 美國Vicam公司。

黃曲霉毒素標準溶液（AFB10.893 μg/mL、AFB20.304 μg/mL、AFG11.046 μg/mL、AFG20.334 μg/mL）、OTA標準溶液（2.0 μg/mL）、ZEN標準溶液（50 μg/mL）、DON標準溶液（100 μg/mL）、T-2毒素標準溶液（100 μg/mL）、乙酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀（配有熒光檢測器、紫外檢測器和Chemstation色譜工作站） 美國安捷倫公司；光化學衍生器 美國AURA Industries公司；6位泵流操作架 北京中撿維康公司；PL403IC型電子分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司；Pulverisette14高速旋轉(zhuǎn)粉碎機 德國Fritsch公司；N-EVAP氮吹儀 美國Organomation Associates公司；多用途旋轉(zhuǎn)搖床 美國Scientific Industries公司；GT10-1高速離心機 北京時代北利離心機有限公司；Milli-Q超純水制備儀 美國 Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌毒素混合標準溶液的配制

移取一定體積AFS、OTA、ZEN、DON、T-2毒素標準溶液，用甲醇稀釋成真菌毒素混合標準儲備液，使AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEN、OTA、DON、T-2毒素質(zhì)量濃度分別為178.6、60.8、209.2、66.8、2 000、200、40 000、7 000 ng/mL。臨用前用甲醇-水（50∶50，V/V）溶液稀釋成合適質(zhì)量濃度梯度的混合標準工作液。

1.3.2 樣品加標

將糧食樣品用高速粉碎機粉碎過0.5 mm篩。準確稱取空白玉米樣品5.0 g（精確到0.01 g），向玉米粉末中分別添加適量AFS、OTA、ZEN、DON、T-2毒素標準溶液，密封避光過夜，次日進行提取檢測。用上述方法制備3 個加標水平的小麥、玉米加標樣品，使樣品中各真菌毒素的含量如表1所示，用于提取方法優(yōu)化、回收率和精密度實驗。

表1 加標樣品中各真菌毒素添加量Table1 Concentrations of 8 mycotoxins in spiked samples

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（100 mm×4 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇-乙腈（50∶50；V/V）為流動相A，0.1%乙酸溶液為流動相B，0～11 min流動相組成35% A＋65% B，11～23 min流動相組成55% A＋45% B，23～28 min流動相組成逐漸恢復為35% A＋65% B。

檢測器：使用可變波長檢測器（variable wavelength detector，VWD）串聯(lián)光化學衍生器串聯(lián)熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）同時進行檢測。VWD條件為波長218 nm，檢測DON；波長202 nm，檢測T-2毒素；FLD條件為光化學衍生，激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長450 nm，檢測AFB1、AFB2、AFG1、AFG2；激發(fā)波長274 nm、發(fā)射波長460 nm，檢測ZEN；激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長460 nm，檢測OTA。

1.3.4 樣品的提取與凈化

取5 g準備好的加標樣品或糧食樣品至離心管中，加入20 mL 80%乙腈溶液。在多用途旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩提取30 min，常溫條件下以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，準確移取2 mL上清液（相當于0.5 g樣品），加入33 mL磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋，搖晃混勻。

將35 mL稀釋液全部通過VICAM Myco6in1免疫親和層析柱，調(diào)節(jié)壓力使溶液以2～3 mL/min的流速緩慢通過。用10 mL超純水淋洗柱子。加入1.5 mL甲醇，調(diào)節(jié)壓力使其以1～2 mL/min的流速緩慢洗脫，收集洗脫液，當大部分甲醇通過時，停止加壓，靜置3～5 min，再加入1.5 mL甲醇，二次洗脫，合并全部洗脫液，于50 ℃條件下氮氣吹干，準確加入0.5 mL甲醇-水（50∶50，V/V）溶液定容，渦旋振蕩1 min，過0.45 μm有機濾膜，供上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

多種真菌毒素的液相檢測，常用甲醇、乙腈或甲醇乙腈混合液作為流動相的有機相，常用的水相有磷酸鹽緩沖液[16]，0.1%乙酸溶液[17′19-20]和0.5%甲酸溶液[21]。根據(jù)實驗室儀器為二元泵的特點，以及大量真菌毒素檢測積累的經(jīng)驗，選擇甲醇-乙腈-0.1%乙酸溶液[4]作為流動相，并對流動相條件進行優(yōu)化。以甲醇-乙腈（50∶50，V/V）為流動相A，0.1%乙酸溶液為流動相B，比較了幾種不同流動相配比的分離效果和保留時間：在0～12 min，對比了35% A＋55% B、30% A＋70% B和40% A＋60% B 三種流動相配比對AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON的分離效果；在12～24 min，對比60% A＋40% B、55% A＋45% B和50% A＋50% B 三種流動相配比對ZEA、OTA、T-2毒素3 種毒素的分離效果。

表2 不同流動相條件下8 種真菌毒素的分離效果和保留時間Table2 Separation efficiency and retention times of 8 mycotoxins with different mobile phhaasseess

由表2可知，最優(yōu)流動相條件為0～11 min流動相組成35% A＋65% B，11～23 min流動相組成55% A＋45% B，23～28 min流動相組成逐漸恢復為35% A＋65% B。優(yōu)化條件下8種真菌毒素色譜圖見圖1。

圖1 色譜條件優(yōu)化后8 種真菌毒素色譜圖Fig.1 Chromatograms of 8 mycotoxins under the optimized mobile phase conditions

2.2 方法的線性范圍與檢出限

在1.3.3節(jié)色譜條件下，分別測定8 種真菌毒素的系列標準溶液，以目標峰的峰面積為縱坐標（y），各真菌毒素質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標（x），繪制標準曲線；逐級稀釋法分析方法的檢出限和定量限，根據(jù)信噪比為3的峰響應值，得出方法檢出限；根據(jù)信噪比為10的峰響應值，得出方法的定量限，結(jié)果見表3。

表3 液相色譜法同時檢測8 種真菌毒素的線性回歸方程、檢出限和定量限Table3 Linearity and sensitivity of the HPLC method for detection limit and quantification limit of mycotooxxiinnss

2.3 提取凈化方法的優(yōu)化

表4 提取凈化方法Table4 Extraction and clean-up methodsthods

根據(jù)8 種真菌毒素的特性并參考相關(guān)研究的前處理方法[17-25]，取5 g玉米加標樣品，采用甲醇、乙腈、乙酸、水、PBS等試劑，設(shè)計并比較7 種不同提取凈化方法。具體方法見表4，比較結(jié)果見表5。

表5 不同提取凈化方法玉米加標樣品回收率（n==33）Table5 Recoveries of myco toxins with different extraction and cleanup methods (spiked coorrnn nn == 33))

由表4和表5可見，方法1對AFB1、AFB2、AFG1、ZEN、OTA、T-2的提取效果較差；方法2對AFG2和T-2的提取效果差；方法3、4對DON和T-2的提取效果較差；方法6對T-2毒素的回收率偏低；方法7與方法5相比提取溶劑中加了酸，結(jié)果明顯降低了ZEN、OTA和T-2的回收率；提取方法5同時滿足8 種真菌毒素的回收率要求。

2.4 方法精密度與回收率

將高、中、低3 個水平玉米和小麥多種真菌毒素加標樣品，使用最優(yōu)提取方法和儀器條件，進行重復性實驗，每天測10 次，連續(xù)測5 d，結(jié)果見表6。玉米為80.0%～104.5%，小麥為83.2%～102.8%。方法精密度為2.6%～10.2%。

表6 方法的精密度與回收率Table6 Precision and recovery of the methodethod

3 結(jié) 論

本實驗建立了免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法同時檢測糧食中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN、DON和T-2毒素的分析方法，并利用本方法對玉米和小麥樣品進行了檢測。實驗結(jié)果表明，本方法具有較高的靈敏度、精密度、回收率；樣品前處理比傳統(tǒng)方法簡便快捷，檢測時間短，從提取、凈化到色譜分離、結(jié)果計算，一份樣品8 種真菌毒素同時分析耗時大約2 h，檢測效率高，檢測成本低。

實際樣品檢測表明，本方法能夠滿足對樣品快速、高通量的檢測要求及糧食安全限量的要求，可作為真菌毒素檢測國家標準方法的替代法用于我國基層實驗室和尚未配置液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的監(jiān)測實驗室開展糧食真菌毒素污染監(jiān)測工作。

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Simultaneous Analysis of 8 Mycotoxins in Grains by High Performance Liquid Chromatography

LI Rui XIE Gang*′WANG Songxue
(Academy of State Administration of Grain Beijing 100037′China)

A rapid analytic method using high performance liquid chromatography (HPLC was established for the simultaneous determination of aflatoxins including AFB1′AFB2′AFG1and AFG2′ochratoxin A zearalenone deoxynivalenol and T-2 toxin in grains The samples were extracted with acetonitrile-water and cleared up with an immunoaffinity column (IAC). The separation of the targeted compounds was performed on an Agilent Elipse Plus C18column (100 mm×4 mm′3.5 μm using a mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile : methanol : water : acetic acid with a flow rate of 1 mL/min at 35 ℃. The injection volume was 20 μL The detection system was variable wavelength detector (VWD)-PHRED system-fluorescence detector (FL D). The limits of detection (LODs of AFB1′AFB2′AFG1′AFG2′ZEN OTA DON and T-2 toxin were 0.446′0.152′0.523′0.334′7′0.7′200′and 100 ng/mL respectively The recoveries of samples spiked with these mycotoxins were in the ranges of 80.0% - 104.5% for corn and 83.2% - 102.8% for wheat The precision va lues associated with the method expressed as relative standard deviation (RSD values were between 2.6% and 10.2%. It took only 2 hours to complete an analysis The method was suitable for the determination of common 8 mycotoxins in raw grains with the advantages of simplicity rapidness sensitivity and good reproducibility.

aflatoxins (AFB1′AFB2′AFG1′AFG2); zearalenone deoxynivalenol T-2; ochratoxin A grain HPLC immunoaffinity columns (IAC)

TS207.3

A

1002-6630（2015）06-0206-05

10.7506/spkx1002-6630-201506039

2014-05-22

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA101609）；北京市科委項目（Z121100008512001）

黎睿（1987—），男，研究實習員，學士，研究方向為糧油質(zhì)量安全檢測與控制。E-mail：lr@chinagrain.org

*通信作者：謝剛（1974—），男，副研究員，碩士，研究方向為糧油質(zhì)量安全檢測與防控。E-mail：xg@chinagrain.org