鄭新寶，唐 倩，徐世永，毋狀元

（1.新疆畜牧科學院畜牧科學研究所，新疆 烏魯木齊830000；2.金陵科技學院，江蘇 南京210014）

催乳素（prolactin，PRL）又名促乳素，是脊椎動物腺垂體分泌的單鏈多肽類激素，屬于生長激素／催乳素家族［1］。催乳素通過與靶細胞膜表面的催乳素受體結(jié)合，啟動JAK2／STAT5信號傳導途徑，最終激活反式作用因子，使其作用于乳蛋白基因啟動子區(qū)的靶序列，啟動或增強以乳蛋白基因啟動子為作用元件的靶基因的表達［2］。

大量的試驗研究都證明催乳素在促進哺乳動物個體的乳腺發(fā)育、乳汁生成、發(fā)動和維持泌乳方面發(fā)揮重要作用［3］。因此催乳素基因可被視為對奶牛泌乳性能具有重要作用的候選基因［4］。目前，國內(nèi)外不少學者已對催乳素基因多態(tài)性進行群體遺傳及其與生產(chǎn)性能關聯(lián)研究，但還需進一步分析，以確定該基因確切的遺傳效果。本試驗運用PCR－RFLP技術對新疆地區(qū)中國荷斯坦牛催乳素基因調(diào)控區(qū)多態(tài)性進行檢測和分析，為探尋催乳索基因調(diào)控區(qū)與產(chǎn)奶量、乳蛋白、乳脂率等經(jīng)濟性狀的相關程度，篩選出對產(chǎn)奶性狀有顯著影響的基因型，為催乳素基因作為分子遺傳標記應用于奶牛早期選種提供理論和技術參考。

1 材料及方法

1.1 材料

試驗樣品 本試驗以新疆天山畜牧生物股份有限公司種公牛站中國荷斯坦種公牛和奶牛繁育場高產(chǎn)中國荷斯坦奶牛為研究對象，共采集荷斯坦奶牛血樣357頭份。樣品用EDTA抗凝采血管，采用頸靜脈方法采集。樣品采集混勻后低溫帶回實驗室，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

性狀的表型記錄 試驗個體均有完整系譜檔案資料和生產(chǎn)性能測定（DHI）記錄，包括：305d產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳脂率和體細胞等項目。

1.2 主要儀器設備

高速冷凍離心機、PCR擴增儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋，凝膠成像系統(tǒng)、瓊脂糖水平電泳槽、穩(wěn)壓電泳儀、電子天平、磁力攪拌器、移液器、振蕩器、微型離心器、微波爐、冰箱等。

1.3 主要試劑及配制

Bio－spin全血基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖（Agarose）、顯色劑 Goldview、去離子水和蒸餾水、DNA Maker（DL 2000和1kb）、溴酚藍、配制 TBE液的藥品：二羥甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、2×PCR Mix酶、PRL正反引物PRLR和PRLFRFLP用限制性內(nèi)切酶：Rsa I酶和Buffer 4。

2 試驗方法

2.1 奶牛DNA的提取

將200μL樣品，10μL PK solution ，200μL Lysis B Buffer加入離心管，震蕩混勻5～10s，在水浴鍋中56°C溫育10min后，加入200μL無水乙醇，震蕩混勻5～10s，再將上述液體轉(zhuǎn)移至有收集管的spin column，6 000～8 000×g離心1min，棄去套管內(nèi)液體，加入500μL WB1Buffer，10 000×g離心30～60s，棄去套管內(nèi)液體，加入700μL Wash Buffer，10 000×g離心30～60s，棄去套管內(nèi)液體，再13 000×g離心2min，并將液體移到離心管。最后，加入100～200μL Elution Buffer，靜置1min，并13 000×g離心1min，丟棄spin column，離心管內(nèi)液體含有基因組DNA，低溫保存。

2.2 DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

在100mL的1×TBE中加入1.5g的瓊脂糖，制成的1.5%瓊脂糖溶液。將5μL的DNA樣品和2μL的溴酚藍混合均勻后，加入點樣孔，同時點一個DNA Marker（1kb），100V電泳30～45min左右，再用紫外分析儀觀察結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.3 PCR擴增

2.3.1 PCR引物設計 引物相關信息見表1。

表1 PCR引物信息（20μL）

2.3.2 PCR反應體系和條件 PCR反應體系采用2×PCR Mix酶。

反應條件最主要的是退火溫度和循環(huán)次數(shù)。即在確定每對引物的PCR退火溫度時，先根據(jù)引物序列中的G＋C含量初步確定其退火溫度的大致范圍，然后在此范圍內(nèi)，每隔2°C為一個間隔，利用PCR儀，跑梯度做分析，以檢測擴增效率。

表2 PCR擴增反應體系的組成（20μL）

表3 PCR反應程序

2.4 PCR產(chǎn)物的酶切

PCR擴增完后，用限制性內(nèi)切酶RsaI消化擴增產(chǎn)物12h。PCR反應組成為 Buffer 2：3μL；HindⅢ：0.5μL；PCR 產(chǎn)物：10μL；去離子水：6.5μL。

表4 PCR產(chǎn)物的酶切體系（20μL）

2.5 酶切片段的電泳分離與鑒定

用1.5%的瓊脂糖凝膠對消化完的酶切產(chǎn)物的片段進行電泳分離，比較反應完畢后的限制性酶切片段的多態(tài)性。其中未被Rsa I酶切開的片段為AA型，被RsaI酶切開一部分的片段為AB型，被RsaI酶完全切開的片段為BB型。

2.6 群體遺傳學分析

對多態(tài)位點的基因型與產(chǎn)奶量、乳蛋白率、乳脂率進行關聯(lián)分析，統(tǒng)計模型為：Yijk＝μ＋αi＋βj＋eijk，其中Yijk為性狀觀察值，μ為群體均值，αi為基因型效應值，βj為群組效應值，eijk為隨機殘差效應。用SAS8.2軟件包的GLM 程序進行方差分析，估計不同基因型的最小二乘均值，計算基因的加性效應、顯性效應并進行顯著性檢驗；用R軟件中的Genetics包計算多態(tài)位點的基因頻率、基因型頻率、雜合度、有效等位基因含量和多態(tài)信息含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取及PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果

從電泳檢測圖1可以看出，每條泳道都有一條清晰，明亮的帶，且?guī)缀鯖]有拖尾的現(xiàn)象，說明提取的基因組DNA質(zhì)量較好。

通過特異性引物的PCR擴增得到的產(chǎn)物是bPRL的外顯子Ⅲ的序列，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，PCR擴增產(chǎn)物明亮、整齊、無雜帶。擴增產(chǎn)物濃度較高，達到進行酶切的要求。

圖1 DNA提取結(jié)果電泳圖譜

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

3.3 PCR產(chǎn)物酶切

用Rsa I酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，部分樣本酶切結(jié)果見圖3。從圖3可見，群體中存在3種基因型。其中AA基因型，片段大小為156bp；AB基因型，片段大小為156bp、82bp、74bp；BB基因型，片段大小為82bp、74bp。

因為瓊脂糖凝膠本身的分辨率的原因，相差20 bp以內(nèi)的條帶，不能完全分辨出來，切出的兩條帶會重疊在一起，不易看出。

圖3 PCR產(chǎn)物酶切反應結(jié)果

第1、3、6、7泳道為 AA 基因型；第2、4泳道為AB基因型；第5泳道為BB基因型。

3.4 群體遺傳特征統(tǒng)計分析

從表4中可以看出，AA型為優(yōu)勢基因型，A等位基因為優(yōu)勢等位基因。從表5中可以看出，試驗牛群處于低度多態(tài)（PIC＜0.25）。通過卡方適合性檢驗得出P＜0.05，差異顯著，說明該位點在研究群體中處于Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)。

表4 PRL的基因型和等位基因頻率

表5 PRL的多態(tài)信息含量、雜合度及有效等位基因數(shù)

3.5 PRL基因多態(tài)性與荷斯坦牛泌乳性狀的關聯(lián)分析

表6顯示了PRL基因不同基因型對中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的影響?？梢钥闯?，就乳蛋白率而言，BB基因型個體的乳蛋白率顯著大于AA基因型個體（P＜0.01），BB基因型個體的乳蛋白率大于AB基因型個體（P＜0.05），但AA基因型個體與AB基因型個體間差異不顯著（P＞0.05）。表明A基因?qū)χ袊伤固鼓膛Ｈ橹视酗@著影響。

表6 三種基因型不同形狀表型值的統(tǒng)計

4 討論

PRL基因與產(chǎn)奶量和乳脂產(chǎn)量等密切關聯(lián)，是奶牛產(chǎn)奶性狀主要候選基因。在本研究中，試驗群體的多態(tài)性較低，遺傳變異不大，選育工作強度不大。本試驗的奶牛群體處于Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)。導致出現(xiàn)不平衡狀態(tài)的原因可能是：①該奶牛群體的父母代（包括種公牛和成母牛）是90年代末期從美國引進的，有可能會對有利基因進行過高強度的選擇；② 在奶牛育種工作中隨著人工授精技術的廣泛開展，使得群體間進行非隨機交配。

國內(nèi)外學者已對PRL基因多態(tài)性進行了分析。眾多研究結(jié)果不盡一致。1990年，Cowan等利用RFLP技術對位于23號染色體上的催乳素基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)AA型與BB型的產(chǎn)奶量、干酪率和蛋白率分別相差 282.9kg、48.58%、53.67%［5］。周國利等通過PCR－RFIP法分析了bPRlexon3在543頭北京荷斯坦母牛中的多態(tài)性。結(jié)果表明：在泌乳l期AA和AB基因型奶牛的奶、乳脂和乳蛋白產(chǎn)量高于BB基因型（P＜0.01）。在泌乳Ⅱ期，AB基因型奶牛的奶、乳脂和乳蛋白產(chǎn)量高于AA基因型（P＜0.01）；在泌乳Ⅱ、Ⅲ期，AA基因型奶牛的乳蛋白率高于 AB基因型［6］。xiucai Hu等通過PCR－SSCP的方法分析了PRL基因與中國荷斯坦奶牛產(chǎn)乳性狀的相關性.研究表明PRL基因與產(chǎn)奶量和乳脂產(chǎn)量等有密切的聯(lián)系［7］。李吉濤等（2004）采用PCR－RFLP技術，在99頭荷斯坦牛中檢測到催乳素基因AA、AB、BB3種基因型，同時結(jié)合產(chǎn)奶性狀進行最小二乘分析，結(jié)果表明：3種基因型的奶牛平均產(chǎn)奶量差異顯著（P＜0.05），BB型高于AB型，AB型高于AA型；乳蛋白率差異極顯著（P＜0.01），BB型最高，AA 型最低；乳脂率差異不顯著（P＞0.05）。表明PRL基因?qū)δ膛．a(chǎn)奶性狀具有重要影響［8］。在本試驗新疆地區(qū)奶牛群體內(nèi)，RFLP位點上具有BB基因型的個體在乳蛋白率、乳脂率、產(chǎn)奶量等性狀上明顯優(yōu)于AA和AB型個體，基因型對乳蛋白率的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。但BB基因型個體數(shù)太少，因此，等位基因B的作用有必要進一步擴大樣本含量以驗證?；蛐虰B有可能作為影響產(chǎn)奶性狀的一個候選基因型進行分子遺傳標記，應用到中國荷斯坦奶牛分子育種中。

［1］ 郭彥斌，楊海玲，王慧等.奶牛催乳素（PRL）及其受體（PRLR）基因研究進展［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2009，40（3）：469－472.DOI：10.3969／j.issn.1000－2324.2009.03.033.

［2］ 陳丹霞，袁靜.DNA多態(tài)性與奶牛泌乳性狀相關基因的研究進展［J］.河南畜牧獸醫(yī)（綜合版），2010，31（1）：13－16.

［3］ 張秀紅，甘海云.催乳素基因與奶牛產(chǎn)奶性能的關系［J］.乳業(yè)科學與技術，2007，30（1）：47－48.DOI：10.3969／j.issn.1671－5187.2007.01.015.

［4］ 李吉濤，杜立新.中國荷斯坦牛催乳素基因型與產(chǎn)奶性狀的相關分析［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2004，35（4）：553－555，559.

［5］ Cowan CM，Bentine MR，Ax RL，et al.Structural variation around prolactin gene linked to quantitative traits in all elite Holstein sire family［J］.Theory Apply Genet，1990，79：577－582.

［6］ 周國利，朱奇，吳玉厚等.奶牛催乳素基因多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀的關系［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2006，28（1）：80－83.DOI：10.3969／j.issn.1000－5684.2006.01.023.

［7］ Xiucai Hu，Hong Chen，et al.Single nucleotide poly－morphisms in bovine PRL gene and their associations with milk production traits in Chinese Holsteins［J］.Mol Biol Rep，2009，（11）：9762－9765.

［8］ 李吉濤，杜立新.中國荷斯坦牛催乳素基因型與產(chǎn)奶性狀的相關分析［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2004，35（4）：553－555，559.