陳麗莉，范國(guó)洽，韓蕊，石志平，王濤，張潔，王雪，周亞茹

二甲雙胍降低2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈磷酸化絲裂原活化蛋白激酶的蛋白表達(dá)

陳麗莉，范國(guó)洽，韓蕊，石志平，王濤，張潔，王雪，周亞茹

目的：探討p38絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK）與2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變的關(guān)系及二甲雙胍的干預(yù)作用。

方法：25只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素注射建立2型糖尿病大鼠模型。將成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為2組：2型糖尿病空白對(duì)照組（2型糖尿病組，n=7）、2型糖尿病+二甲雙胍干預(yù)組（二甲雙胍組，n=8）。二甲雙胍組給予二甲雙胍200 mg/kg灌胃8周，于干預(yù)末行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)，次晨心尖取血并分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖、血脂等生化指標(biāo)；放免法測(cè)定胰島素水平；采用酶聯(lián)免疫吸附方法測(cè)定血清細(xì)胞間黏附分子-1（ ICAM-1）， 血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和核因子-κB水平；取胸主動(dòng)脈進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察血管病理變化；免疫組化法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1蛋白的表達(dá)。

結(jié)果：（1）HE染色可見2型糖尿病組大鼠主動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)層次不清，內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫大變性，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維增生。（2）與對(duì)照組相比，2型糖尿病組大鼠空腹胰島素[（20.00 ± 5.91） mIU/L vs（11.34 ± 3.88）mIU/L]、核因子-κB [（170.22±21.53） μmol/L vs（78.68±12.15） μmol/L]、ICAM-1[（130.59±16.00） pg/ml vs（75.63±19.52）pg/ml]、VCAM-1 [（990.19±119.18） ng/ml vs（616.54±54.51） ng/ml]、總膽固醇 [（4.15±0.41） mmol/L vs（2.18±0. 93 ） mmol/L]、甘油三酯 [（1.83±0.40） mmol/L vs（0.81±0.27）mmol/L]、低密度脂蛋白膽固醇[（2.53±0.44） mmol/L vs （1.24±0.47）mmol/L]水平明顯升高（P＜0.05），胰島素曲線下面積（30.78 ± 11.25）mIU·L-1·h vs（47.55 ± 5.23）mIU·L-1·h明顯降低（P＜0.05），主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、核因子-κB、MCP-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)二甲雙胍組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、VCAM-1、甘油三酯、總膽固醇水平較2型糖尿病組明顯降低（P＜ 0.05）；二甲雙胍組和2型糖尿病組間胰島素曲線下面積無明顯差異（P＞ 0.05）。二甲雙胍組大鼠主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1蛋白表達(dá)水平也較二甲雙胍組明顯降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：p38 MAPK信號(hào)通路的激活在糖尿病大血管病變發(fā)生發(fā)展中起重要作用，二甲雙胍通過降低p38 MAPK磷酸化水平、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂代謝而起到血管保護(hù)作用。

糖尿病；動(dòng)脈粥樣硬化；p38絲裂原活化蛋白激酶；二甲雙胍

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:487.)

研究顯示，動(dòng)脈粥樣硬化的病理改變與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的過度激活有關(guān)[1,2]。磷酸化p38 MAPK通過啟動(dòng)核因子-κB，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達(dá)，加劇中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，誘發(fā)血栓形成和血管再狹窄，介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成。

二甲雙胍除能夠有效降糖、降低胰島素水平及增加胰島素敏感性外，還有抗炎、抗氧化應(yīng)激、改善血脂、改善血管內(nèi)皮功能等作用[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過高糖、高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）制備2型糖尿病大鼠模型，繼而采用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)各組大鼠血糖、血脂等生化指標(biāo)，血清核因子-κB、VCAM-1、ICAM-1水平變化及胸主動(dòng)脈中磷酸化的p38 MAPK蛋白表達(dá)水平，探討p38 MAPK與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及二甲雙胍對(duì)2型糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組：實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2012-11至2013-08，25只體重80 g左右的4周齡Wistar雄性大鼠（SPF級(jí)，購自河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組（n=6）和實(shí)驗(yàn)組（n=19），對(duì)照組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)（含20%蔗糖、10%熟豬油、2.5%膽固醇、1%膽酸、66.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料）。喂養(yǎng)4周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ（美國(guó)Sigma公司，30 mg/kg，用前以檸檬酸緩沖液配成1%的濃度），對(duì)照組僅注射等容積的檸檬酸緩沖液。于實(shí)驗(yàn)的第6周即注射STZ 2周后，空腹8小時(shí)測(cè)血糖≥ 7.8 mmol/L者為糖尿病成模標(biāo)準(zhǔn)[6]。19只實(shí)驗(yàn)大鼠中造模成功者15只。將成模實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2組：2型糖尿病空白對(duì)照組（2型糖尿病組, n=7）、2型糖尿病+二甲雙胍干預(yù)組（二甲雙胍組，n=8，二甲雙胍由中美上海施貴寶制藥有限公司提供）。二甲雙胍組給予二甲雙胍200 mg/kg[7]溶于飲用水中灌胃，每日1次，對(duì)照組和2型糖尿病組給予等量飲用水灌胃，每周測(cè)體重1次，共8周，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程共持續(xù)14周。二甲雙胍組有1只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡（可能死于高血糖）。

觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法：二甲雙胍干預(yù)第8周末，行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（禁食12 h，腹腔注射葡萄糖2 g/kg，在注射葡萄糖后0、30、60、90、120 min尾靜脈采血），采用近似梯形的計(jì)算公式計(jì)算葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積。次日麻醉下心尖取血，分離血清，檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、 核因子-κB、ICAM-1、VCAM-1水平。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自bio-swamp公司。碘[125I]胰島素放射免疫分析藥盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

取約1 cm胸主動(dòng)脈以4%多聚甲醛固定，進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察血管病理變化；免疫組化法測(cè)定胸主動(dòng)脈中磷酸化的p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1的蛋白表達(dá)水平。兔抗大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1、核因子-κB抗體購自武漢博士德生物公司，兔抗大鼠p38 MAPK單克隆抗體購自上海bioworld公司。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（最小值，最大值）表示。正態(tài)分布及方差齊性資料采用 t檢驗(yàn)及單因素方差分析，組間兩兩比較采用 SNK-q 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的資料，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠血清生化指標(biāo)比較（表 1）：2型糖尿病組和二甲雙胍組大鼠空腹血糖水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），二甲雙胍組空腹血糖較2型糖尿病組明顯下降 [（9.03±1.49）mmol/L vs（12.99±2.07）mmol/L，P＜0.05]；2型糖尿病組和二甲雙胍組葡萄糖曲線下面積水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），但前兩組組間葡萄糖曲線下面積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2型糖尿病組大鼠空腹胰島素明顯高于對(duì)照組和二甲雙胍組（P＜0.05），對(duì)照組胰島素曲線下面積水平明顯高于2型糖尿病組和二甲雙胍組（P＜0.05），但2型糖尿病組和二甲雙胍組的胰島素曲線下面積水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2型糖尿病組和二甲雙胍組大鼠TG 、TC、LDL-C、ICAM-1、VCAM-1、核因子-κB水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），二甲雙胍組TG 、TC、ICAM-1、VCAM-1、核因子-κB水平低于2型糖尿病組（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，2型糖尿病組和二甲雙胍組HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)三組大鼠血清生化指標(biāo)

注：與對(duì)照組比*P＜0.05；與2型糖尿病組比△P＜0.05。#1只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡

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三組大鼠病理形態(tài)學(xué)比較（圖1）：對(duì)照組可見血管壁結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。2型糖尿病組主動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)層次不清，內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維增生血管壁彌漫性隆起，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞排列紊亂、增生，內(nèi)有脂質(zhì)沉積，膠原纖維和彈性纖維增多。二甲雙胍組血管內(nèi)皮細(xì)胞基本完整，內(nèi)膜偶有增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列基本整齊。

三組大鼠p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1蛋白表達(dá)的改變（圖2）：胸主動(dòng)脈p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1蛋白表達(dá)于血管內(nèi)膜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒沉著。免疫組織化學(xué)表達(dá)積分見表2。與對(duì)照組相比，2型糖尿病組主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與2型糖尿病組相比，二甲雙胍組主動(dòng)脈磷酸化p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈蘇木素伊紅染色（×200倍）

圖2 三組大鼠主動(dòng)脈中單核細(xì)胞趨化蛋白-1、 核因子-κB、p38絲裂原活化蛋白激酶的表達(dá)（×200）

表2 三組大鼠免疫組化表達(dá)積分#

3 討論

糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化，它與單純的動(dòng)脈粥樣硬化相比病變范圍大、程度重、發(fā)生早[8]。然而，糖尿病大血管病變的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，目前認(rèn)為，2型糖尿病大血管病變除與糖脂代謝紊亂有關(guān)外，尚與其他因素，如血管內(nèi)皮功能損傷、炎癥和氧化應(yīng)激、 MAPK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)[9,10]。 Yoon等[11]研究表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、形成活性氧簇，誘導(dǎo)核因子-κB、促M(fèi)APK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，從而使炎癥因子的表達(dá)增加，血管內(nèi)皮功能受損，導(dǎo)致糖尿病大血管病變的發(fā)生。上述研究提示，糖尿病大血管病變與炎癥因子和內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。MAPK介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物信號(hào)引起核反應(yīng)的重要通路，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡的調(diào)節(jié)中起到至關(guān)重要的作用，動(dòng)脈粥樣硬化的病理改變與MAPK的過度激活有關(guān)[1,2]，其中p38 MAPK通路與內(nèi)皮細(xì)胞損傷關(guān)系密切，是參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)的重要通路：非磷酸化的p38 MAPK通過磷酸化狀態(tài)，促進(jìn)下游底物磷酸化來快速實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞，啟動(dòng)核因子-κB，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VCAM-1、ICAM-1，加劇中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，誘發(fā)血栓形成和血管再狹窄，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化形成。2型糖尿病患者存在的胰島素抵抗、高血糖和（或）高游離脂肪酸水平、以及炎性細(xì)胞因子等均能激活p38 MAPK信號(hào)通路[12]。本實(shí)驗(yàn)中，2型糖尿病組大鼠胸主動(dòng)脈HE染色可見主動(dòng)脈發(fā)生了炎癥和損傷，另外，2型糖尿病組大鼠主動(dòng)脈p38 MAPK蛋白表達(dá)水平及血清中核因子-κB、VCAM-1、ICAM-1水平明顯升高，說明p38 MAPK及炎癥因子參與了2型糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二甲雙胍組空腹血糖較2型糖尿病組明顯降低，但葡萄糖曲線下面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與二甲雙胍主要通過減少肝糖輸出降低空腹血糖，但對(duì)餐后血糖作用較弱有關(guān)。胰島素曲線下面積在2型糖尿病組有明顯的降低，可能與糖尿病時(shí)高糖狀態(tài)對(duì)胰島β細(xì)胞的抑制狀態(tài)有關(guān)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于2型糖尿病組，二甲雙胍組可見到胰島素曲線下面積有增加的趨勢(shì)，可能與二甲雙胍抑制肝糖輸出、促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，降低空腹血糖、改善葡萄糖負(fù)荷后血糖，一定程度改善胰島β細(xì)胞分泌功能有關(guān)。

現(xiàn)有研究認(rèn)為，有效地控制血糖可延緩但不能防止2型糖尿病患者大血管并發(fā)癥的發(fā)生，這可能與2型糖尿病患者常合并血脂代謝異常、高血壓，存在氧化應(yīng)激、凝血及纖溶系統(tǒng)紊亂等因素有關(guān)[13,14]。研究表明，二甲雙胍能改善血脂水平、抑制氧化應(yīng)激和黏附分子的形成，能夠抗炎、改善血管內(nèi)皮功能并激活纖溶系統(tǒng)，具有降糖以外的大血管保護(hù)作用[3-5]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二甲雙胍組的血清TC、TG、核因子-κB、VCAM-1、ICAM-1水平較糖尿病組明顯降低，且胸主動(dòng)脈組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)等情況明顯改善，進(jìn)一步說明二甲雙胍除降糖外，還可起到改善血脂、抗炎、改善血管內(nèi)皮功能等作用，從而改善糖尿病大血管病變。本研究還發(fā)現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)組相比，二甲雙胍組p38 MAPK、核因子-κB、單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)水平明顯下降，與Tseng 等[15]的研究結(jié)果一致，說明二甲雙胍可能通過下調(diào)血管p38 MAPK的表達(dá)、抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻斷白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、黏附分子及炎性介質(zhì)的釋放，從而有效改善糖尿病大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化情況，發(fā)揮對(duì)糖尿病大血管病變的保護(hù)作用。

總之，p38 MAPK參與了糖尿病大血管病變的發(fā)生。通過干預(yù)p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的某些環(huán)節(jié)可緩解糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展。二甲雙胍除降糖作用外，還可通過下調(diào)血管p38 MAPK磷酸化水平、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂代謝，發(fā)揮對(duì)糖尿病大血管的保護(hù)作用。

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Metformin Decreasing the Aortic p38 MAPK Protein Expression in Experimental Rats With Type 2 Diabetes Mellitus

CHEN Li-li, FAN Guo-qia, HAN Rui, SHI Zhi-ping, WANG Tao, ZHANG Jie, WANG Xue, ZHOU Ya-ru.
Department of Endocrinology, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

Objective: To explore the relationship between p38 MAPK protein expression and macro vascular lesions in type 2 diabetes mellitus (DM) rats with the effect of metformin intervention.Methods: A total of 25 healthy male Wistar rats were randomly divided into 2 groups: Control group, the rats had normaldiet for 4 weeks and then received citrate buffer solution for modeling control, n=6. Experimental group, the rats received high fat diet for 4 weeks and then received streptozotocin injection for DM modeling, n=19; there were 15 rats successfully developed DM and randomly divided into 2 subgroups: DM control (DM-C) group, n=7 and DM + metformin group, n=8, in which DM rats received metformin 200 mg/kg·d for 8 weeks. At the end of intervention, intraperitoneal injections of glucose tolerance test ( IPGTT ) was performed, laboratory biochemical indexes and fasting insulin level were detected, protein expressions of nueclear factor (NF-κB), monocyte chemo-attractant protein-1(MCP-1) in the thoracic aorta were examined by immunohistochemistry.Results: ①HE staining showed that DM-C group had increased tunica intimae thickness, endothelia cell swollen, media smooth muscle disorder and collagen fiber hyperplasia.②Compared with Control group, DM-C group had increased levels of fasting insulin (20.00 ± 5.91) mIU/L vs (11.34 ± 3.88) mIU/L, NF-κB (170.22 ± 21.53) μmol/L vs (78.68 ± 12.15) μmol/L, ICAM-1 (130.59 ± 16.00) pg/ml vs (75.63 ± 19.52) pg/ml, VCAM-1 (990.19 ± 119.18) ng/ml vs (616.54 ±54.51) ng/ml, and increased TC (4.15 ± 0.41) mmol/L vs (2.18 ± 0.39) mmol/L, TG (1.83 ± 0.40) mmol/L vs (0.81 ± 0.27) mmol/L, LDL (2.53 ± 0.44) mmol/L vs (1.24 ± 0.47) mmol/L, P＜0.05; while decreased AUCi (30.78 ± 11.25) mIU·L-1·h vs (47.55 ± 5.23) mIU·L-1·h, P＜0.05; increased protein expressions of p38 MAPK, NF-κB and MCP-1, P＜0.05.③Compared with DM-C group, DM + metformin group presented decreased levels of fasting insulin, NF-κB, ICAM-1, VCAM-1, TC, TG, P＜0.05; increased aortic protein expressions of p38 MAPK, NF-κB and MCP-1; while AUCi was similar between 2 groups, P＞0.05.Conclusion: The activation of p38 MAPK pathway plays an important role in DM macro angiopathy, metformin protects blood vessel via decreasing p38 MAPK level, inhibiting inflammatory reaction and regulating lipid metabolism in DM rats.

Diabetes mellitus; Atherosclerosis; p38 MAPK; Metformin

2014-09-08）

（編輯：漆利萍）

中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床科研專項(xiàng)資金（09010220177）

050051 河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院 內(nèi)分泌二科（陳麗莉、范國(guó)洽、韓蕊、石志平、王雪、周亞茹）， 心血管二科（王濤），河北省骨科生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張潔）

陳麗莉 碩士研究生 主要從事糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制及干預(yù)研究 Email：chenlily163@163.com 通訊作者：周亞茹

Email：lzhouyaru@gmail.com

R541

A

1000-3614（2015）05-0487-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.05.018