秦 楓， 潘孝青， 邵 樂， 李 晟， 李 健， 楊 杰

（江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇南京210014）

碘是動(dòng)物體內(nèi)不可缺少的微量元素，調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成與代謝。甲狀腺激素可以通過參與機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，影響動(dòng)物的生長發(fā)育、繁殖以及機(jī)體健康等。甲狀腺激素是內(nèi)分泌軸的重要激素，對(duì)下丘腦-垂體-生長激素軸有重要的影響。據(jù)報(bào)道，甲狀腺激素在垂體GH合成與分泌中起著關(guān)鍵的作用(Valcavi等，1992)。然而碘攝取過量將導(dǎo)致甲狀腺炎、甲狀腺腫大、甲減/甲亢等疾病的發(fā)生，此外還影響腦發(fā)育（Guo等，2006；Yang等，2006）。本試驗(yàn)擬以獺兔為試驗(yàn)動(dòng)物，探討日糧中不同水平的碘對(duì)獺兔內(nèi)分泌生長軸基因mRNA的影響，為獺兔碘的安全補(bǔ)飼提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理 選擇120只體況良好、體重為（2235.4±13.04）g、4 月齡獺兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)前統(tǒng)一驅(qū)蟲。試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗(yàn)兔場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)前對(duì)兔舍兔籠進(jìn)行徹底清掃、消毒。試驗(yàn)獺兔2只為一籠，分別在早上08∶30和下午15∶30飼喂兩次，試驗(yàn)獺兔飼喂基礎(chǔ)料，飼料為2～3 cm顆粒料，自由飲水，每天清掃衛(wèi)生，并做好各種記錄。預(yù)試期內(nèi)進(jìn)行分組。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將120只獺兔隨機(jī)分為4組，碘添加水平分別為0、0.2、2、4 mg/kg 干物質(zhì)（對(duì)照組、低水平組、中水平組、高水平組）。試驗(yàn)時(shí)間為2012年10—12月，預(yù)試期7 d，正式期28 d。

1.3 試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)日糧配制參照NRC（1977）兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NRC，1977），代謝能供給量為1.2倍的維持需要。碘以碘酸鉀的形式在日糧中添加?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 樣品采集 在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組各隨機(jī)抽取體重相近獺兔5只，空腹24 h后進(jìn)行屠宰，采集垂體、肝臟組織，液氮保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定垂體GH、肝臟IGF-1和IGFBP1 mRNA

1.5.1 總RNA提取 用Trizol法抽提垂體、肝臟樣品中的總RNA，樣品中RNA濃度用紫外分光光度計(jì)（260 nm）測(cè)定。RNA樣品經(jīng)2.0%變性瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后觀察分析，無拖尾現(xiàn)象和其他雜帶，則認(rèn)為RNA樣品質(zhì)量可靠。

1.5.2 RT反應(yīng) 采用10 μL反應(yīng)體系，在0.2 mL Eppendorf管中依次加入模板RNA1.0μL，50μmol/L Oligo dT 0.5 μL，100 μmol/L 隨機(jī)引物 0.5 μl，5×PrimerScript Buffer 2 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RNase free H2O 5.5 μL。 在ABI 9700型PCR儀上37℃保溫15 min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，85℃、5 s終止反應(yīng)。 產(chǎn)物加入 90 μL RNase free H2O稀釋至 100 μL，儲(chǔ)存在-20℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5.3 熒光定量PCR分析 引物序列及擴(kuò)增條件見表 2。 20 μL PCR 反應(yīng)體系：10 μmol/L Forward primer 0.4 μL，10 μmd/L Forward primer 0.4 μL，2×SuperRealPreMix（SYBR Green）10 μL，RNase free H2O 8.2 μL，RT 產(chǎn)物 1 μL。

表2 基因引物序列及擴(kuò)增片段

1.5.4 基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法 以看家基因（GAPDH）作為內(nèi)參基因，以垂體、肝臟組織cDNA作為模板， 進(jìn)行 GAPDH、GH、IGF-1、IGFBP1 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，用得出的CT值制作擴(kuò)增效率曲線。 試驗(yàn)采用比較 Ct法（2－△△Ct）進(jìn)行GH、IGF-1、IGFBP1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)以GAPDH作為持家基因，從而校正不同樣品初始模板量的差異，每個(gè)樣品重復(fù)三次，從而獲得平均 Ct值，采用 2－△△Ct法計(jì)算樣品間 GH、IGF-1、IGFBP1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 2－△△Ct法采用的公式如下：

△△Ct=[Ct（目的基因，試驗(yàn)樣品）-Ct（GAPDH，試驗(yàn)樣品）]-[Ct（目的基因，參照樣品）-Ct（GAPDH，參照樣品）]。

每個(gè)樣品的 2－△△Ct值即是該樣品 GH、IGF-1、IGFBP1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用Excel整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0中單因素ANVOA統(tǒng)計(jì)分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與討論

試驗(yàn)結(jié)果見圖1、2、3。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，中水平組、高水平組垂體 GH、肝臟IGF-1基因mRNA表達(dá)略有下降，GH表達(dá)分別下降3.8%、8.6%，IGF-1表達(dá)分別下降 25.8%、19.6%，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。此外，肝臟IGFBP1基因mRNA表達(dá)高水平組比對(duì)照組高14.2%，但也無顯著影響（P＞0.05）。

圖1 日糧碘對(duì)獺兔垂體GH基因mRNA表達(dá)的影響

圖2 日糧碘對(duì)獺兔肝臟IGF-1基因mRNA表達(dá)的影響

圖3 日糧碘對(duì)獺兔肝臟IGFBP1基因mRNA表達(dá)的影響

碘是甲狀腺激素的重要組成成分，其作用主要通過甲狀腺激素體現(xiàn)的。相關(guān)研究報(bào)道，碘缺乏和碘過量會(huì)影響動(dòng)物體內(nèi)與甲狀腺激素相關(guān)基因的表達(dá)（張瑞等，2009；王琨等，2008）。本試驗(yàn)主要研究了過量碘對(duì)獺兔生長軸相關(guān)激素基因表達(dá)的影響。甲狀腺激素、生長激素和IGF-1是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長和發(fā)育的重要內(nèi)分泌激素。GH通過IGF-1的介導(dǎo)而起生長調(diào)節(jié)作用。肝臟是產(chǎn)生IGF-1的最主要器官。IGF-1的作用主要通過受體IGF-1R介導(dǎo)，它具有酪氨酸激酶活性，并通過PI3K/AKP信號(hào)通路傳遞作用。甲狀腺激素影響生長是通過改變GH的分泌及影響，作用強(qiáng)弱是通過GH調(diào)控IGF-1的合成與分泌實(shí)現(xiàn)的 （Wolf等，1989）。GH/IGF-1軸不僅影響動(dòng)物的生長和其甲狀腺功能，而且還影響甲狀腺激素的代謝 （Torre等，2000；J?rgensen 等，1999）。

本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)日糧添加高碘對(duì)GH/IGF-1生長軸激素基因mRNA表達(dá)沒有顯著影響。分析原因?yàn)椋阂环矫媸窃囼?yàn)獺兔為青年兔，高碘的添加量可能還不到獺兔最大耐受量；另一方面是短期內(nèi)碘的作用還可能受到Wolff-Chaikoff法則的影響。但也有研究報(bào)道，甲狀腺激素可以上調(diào)大鼠海馬組織中GH及其受體的表達(dá)，并促進(jìn)GH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)NSCs和前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化，在腦的發(fā)育期，這種上調(diào)作用呈現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平，進(jìn)入幼年期之后這種促進(jìn)作用僅僅表現(xiàn)在翻譯水平上，提示甲狀腺激素促進(jìn)腦的生長發(fā)育功能可能是通過GH介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的 （湯慧芹，2010）。在外周甲狀腺激素對(duì)維持血清GH的濃度起著重要的調(diào)節(jié)作用 （Davis和Tremont，2007；Silva等，2006）。正常血濃度的甲狀腺激素能增加垂體細(xì)胞GH基礎(chǔ)分泌、甲狀腺激素缺乏可導(dǎo)致垂體GH儲(chǔ)備降低，其機(jī)制可能是甲狀腺激素與垂體細(xì)胞核內(nèi)的甲狀腺激素受體結(jié)合后，作用于GH基因啟動(dòng)子5'上游區(qū)域的正性甲狀腺激素應(yīng)答元件，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GH基因的表達(dá)（Sugawara等，1994）。新近的研究還顯示，甲狀腺激素可以誘導(dǎo)多聚腺苷酸（polyA）的合成來保護(hù)GHmRNA免受核糖核酸酶的降解，從而提高GHmRNA的穩(wěn)定性（Silva等，2006）。除調(diào)控GH基因表達(dá)外，甲狀腺激素還可促進(jìn)垂體細(xì)胞對(duì)促生長激素釋放激素的反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)GH的合成與分泌 （Jones等，1990）。這些現(xiàn)象提示，GH功能的正常發(fā)揮，在很大程度上依賴于甲狀腺激素。GH也可直接或間接調(diào)節(jié)外圍T4的代謝，通過GH誘導(dǎo)外圍T4脫碘轉(zhuǎn)變成 T3（Jorgensen 等，1989）。

3 結(jié)論

綜上所述，試驗(yàn)期內(nèi)，高碘日糧對(duì)獺兔內(nèi)分泌生長軸相關(guān)激素及蛋白表達(dá)無顯著影響，由此可見，短期內(nèi)飼喂高碘日糧不會(huì)引起獺兔內(nèi)分泌軸變化，不會(huì)影響其健康與生長，但相關(guān)研究還需要進(jìn)一步深入，以確定獺兔碘供給安全上限。

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