楊新建 ， 段素云 ， 肖海峻 ， 田 璐， 王偉青 ， 羅紅霞 *

（1.北京農業(yè)職業(yè)學院，北京房山 102442；2.農業(yè)部飼料生物技術重點實驗室，北京海淀 100081；3.中國農業(yè)科學院飼料研究所基因工程研究室，北京海淀 100081）

花生餅（粕）是脫殼花生經(jīng)壓榨或浸提取油后的副產物，其營養(yǎng)豐富，粗蛋白質含量比豆粕大約高出3%（Hwang等，2010）；多糖含量高達32.5%；代謝能水平在所有餅粕類飼料中最高；并含有Mg、K、Ca、Fe、Na、Zn、P、Cu、Mn 等多種礦物質元素。目前，用動植物蛋白制備多肽已成為了研究熱點，這種多肽被認為具有良好的理化性質和水合性質，其溶解度增加，黏度降低，凝膠性降低，發(fā)泡性降低，無過敏反應，消化吸收性好（劉大川和周俊梅，2008；Byun，2001；Wahb，1998），并且具有抗氧化特性，能夠清除體內自由基，達到延長細胞壽命的作用（劉大川，2013；Sarmadi和 Ismail，2010）。本研究以花生餅（粕）作為基質，采用固態(tài)發(fā)酵技術，以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉、產朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳酸桿菌為備選菌株，花生多肽產量為考察指標，篩選獲得多肽產量高、穩(wěn)定的發(fā)酵菌株。旨在為今后優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高多肽產量、品質及活性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 候選菌種 芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌；霉菌：黑曲霉、米曲霉；酵母：產朊假絲酵母、釀酒酵母；乳酸菌：植物乳酸桿菌。上述菌種均由中國農業(yè)科學院飼料研究所基因工程研究室保存。

1.1.2 花生粕（餅） 試驗用花生粕（餅）分別購自山東魯花集團有限公司、天津宇順國際貿易有限公司、北京鶴來科技有限公司、萊州市三元花生油加工廠，粉碎過40目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 活化培養(yǎng)基 霉菌、酵母培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。芽孢桿菌培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基。乳酸菌培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3.2 擴大培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基（液體）。

1.1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 滅菌后的基質（90%花生粕和 10%麩皮）和水按 1∶1（w/w）的比例混合，自然pH。

1.1.4 試劑 牛血清白蛋白、葡萄糖、硫酸銅（CuSO4·5H2O）、酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）、氫氧化鈉、碘化鉀、三氯乙酸（TCA）、石油醚（沸程60～90℃）、3，5-二硝基水楊酸、重蒸酚 （結晶酚）、亞硫酸鈉等均為分析純。

1.1.5 設備 全自動凱氏定氮儀 （型號：KDY-9830，品牌：KETUO）、紫外可見分光光度計（T6，北京普析通用儀器有限責任公司）、索氏提取器（SXT-06、上海洪紀儀器設備有限公司）、電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生粕基本成分測定 粗蛋白質測定采用凱氏定氮法（GB/T 5009·5-2010）；粗脂肪測定按GB/T 5009·6-2003 進行；水分測定按 GB/T5009·3-2010進行；總糖測定采用DNS法。

1.2.2 菌種活化與擴培 芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌活化與擴培方法：保藏菌種劃線（或涂布）相應固體平板，在適宜條件下培養(yǎng)一定時間后，挑取單菌落于相應液體培養(yǎng)基中，根據(jù)其生長曲線，適宜條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期末，備用。

霉菌活化與擴培方法：保藏的斜面菌種轉接于PDA斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，長滿大量黑色（黑曲霉）或黃綠色（米曲霉）孢子，即為活化的斜面種子。 用無菌移液管吸取5 mL無菌水加至斜面上，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，裝入含有玻璃珠的三角瓶中，蓋好塞子振蕩數(shù)分鐘，用血球計數(shù)板測定孢子懸液的濃度，并進行適當稀釋后備用。

1.2.3 各菌種固態(tài)發(fā)酵花生粕試驗 （1）13.5 g花生粕+1.5 g麩皮放入250 mL三角瓶中，121℃、20 min，自然冷卻并打散；（2）量取 11.2 mL 無菌水（考慮花生粕本身含水量）放入50 mL三角瓶中；并按照10%接種量（3 mL，霉菌為107個/mL的孢子懸液），接種各培養(yǎng)至對數(shù)生長期末的菌液，充分混勻；（3）將（2）中混勻好的溶液，均勻的接種到（1）中（多點接種），并用滅菌的玻棒打散成團花生粕。每組三個重復，根據(jù)各菌種生長溫度培養(yǎng)48 h，每12 h翻料一次。對照：在不接種菌種的情況下，所有過程同樣品處理。

1.2.4 多肽含量測定 多肽測定參照史軍（2007）的方法進行。

1.2.4.1 標準曲線繪制 標準蛋白質溶液：準確稱取經(jīng)真空干燥的標準蛋白質——牛血清白蛋白，用雙蒸水配制成10 mg/mL的溶液（可用1 mg牛血清白蛋白/mL在280 nm處的吸光度為0.66來校正）。放置過夜以助溶。

雙縮脲試劑：稱取0.75 g硫酸銅、3 g酒石酸鉀鈉、0.5 g碘化鉀，依次溶解于250 mL水中，攪拌下加入150 mL 10%氫氧化鈉溶液，用冷卻的通過煮沸逐出所溶解二氧化碳的蒸餾水稀釋定容至500 mL。

標準曲線制作：取小試管22支，分為兩組，分別編號0～10，按表1所示順序加入各試劑，在漩渦器上輕輕振動混勻，于37℃水浴下反應30 min后，用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液，540 nm處測定吸光度（A）值。并取兩組測定的平均值。以溶液中蛋白質濃度為橫坐標，A540為縱坐標作標準曲線（R2≥0.9990才可用）。

表1 制作標準曲線具體參數(shù)

1.2.4.2 發(fā)酵樣品處理及多肽含量測定 發(fā)酵結束后，將發(fā)酵物50℃烘干，粉碎，過40目篩，取0.25 g（每個發(fā)酵樣品取2個平行），置于10 mL潔凈離心管中，加入8 mL 10%的三氯乙酸，混勻并室溫振蕩 30 min（200 r/min），然后 5000 r/min離心20 min，取上清液1 mL（記錄上清液總體積，每個樣品做2個平行），加雙縮脲試劑4 mL，于37℃水浴下反應30 min，在540 nm處測定吸光值，根據(jù)標準曲線回歸方程計算上清液中多肽含量（mg/mL）。然后再根據(jù)上清液總體積以及取樣品量計算出發(fā)酵產物中多肽含量/（mg/g）。

未發(fā)酵樣品：90%花生粕+10%麩皮與水按照質量比1∶1混合后，處理同上。

1.2.5 SDS-PAGE檢測花生粕發(fā)酵前后蛋白質分子量分布情況 分別取發(fā)酵前與發(fā)酵后的粉碎花生粕 （40目）各1.0 g，用8 mL 0.03 mol/L Tris-HCL緩沖液（pH 8.0）浸提1 h以上，然后于4℃、3000 r/min離心5 min，取上清液，再于4℃、10000 r/min離心5 min。SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，以溴酚藍作為前沿指示劑。電泳時，取樣品0.5 mL，加入0.5 mL的上樣緩沖液，混勻后在100℃沸水浴3～5 min，再于10000 r/min離心30 s。上樣量為7 μL，樣品在濃縮膠時電壓為40 V，待溴酚藍前沿進入分離膠后增至80 V繼續(xù)電泳，待溴酚藍距離下緣僅有0.5～1.0 cm時結束電泳。膠片經(jīng)染色和脫色后，進行拍照。

1.2.6 備選菌株產多肽穩(wěn)定性試驗 對發(fā)酵產多肽較多的米曲霉、地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母進行3個批次的發(fā)酵試驗（每個批次2個重復），并測定其多肽含量，驗證各備選菌種產多肽的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。P＞0.05為統(tǒng)計學差異不顯著，P＜0.05為統(tǒng)計學差異顯著，P＜0.01為統(tǒng)計學差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同來源花生粕（餅）基本成分測定及樣品選擇 根據(jù)試驗需求，分別收集了4個不同廠家的花生粕（餅），并對其營養(yǎng)成分的含量進行了測定。測定結果見表2。

根據(jù)表2結果可知，不同來源的花生粕（餅）均含有較高含量的蛋白質及總糖，但以來至山東魯花的樣品含量較高；而四個樣品的粗脂肪以及水分含量均較低。并且在粗脂肪含量方面，花生粕顯著低于花生餅（P=0.000＜0.01）。

表2 不同廠家花生粕（餅）營養(yǎng)成分含量%

2.2 多肽含量測定標準曲線 根據(jù)1.2.4所述方法，測定標準蛋白質在540 nm處吸光度 ，結果見表3。

表3 各濃度標準蛋白質在540 nm處吸收值

根據(jù)表3數(shù)據(jù)（平均值）利用Excel制作散點圖，計算出斜率、截距并獲得其公式，以供后面計算所用（圖 1）。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線

2.3 各菌種固態(tài)發(fā)酵結果 根據(jù)1.2.3及1.2.4中方法，測得7株供試菌發(fā)酵花生粕產多肽結果如圖2所示。

根據(jù)上述結果，米曲霉產多肽量最高，為（149.20±14.69）mg/g，產朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌次之。同時，為了進一步驗證上述結果，對各菌種發(fā)酵產物進行多肽提取，進行SDS-PAGE分析，結果見圖3。

圖2 不同菌種作用花生粕產多肽情況

圖3 不同菌種發(fā)酵樣品電泳圖

圖3結果顯示，產朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、米曲霉、釀酒酵母對花生蛋白粕均有一定的降解作用（與對照相比，大分子蛋白被不同程度降解），但以米曲霉為最好，產朊假絲酵母、地衣芽孢桿菌次之，與含量測定結果吻合。

2.4 備選菌種發(fā)酵制備多肽穩(wěn)定性試驗 采用1.2.4中方法，對備選的米曲霉、產朊假絲酵母和地衣芽孢桿菌產多肽穩(wěn)定性進行試驗，結果如圖4、圖5所示。

圖4 產朊假絲酵母發(fā)酵花生粕制備花生多肽穩(wěn)定性試驗

圖5 地衣芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備花生多肽穩(wěn)定性試驗

根據(jù)圖4和圖5的結果可知，首先，產朊假絲酵母三個批次發(fā)酵產物中多肽含量分別為（120.43±7.89）mg/g、（118.95±1.66）mg/g 和（110.39±1.17）mg/g（P ＞ 0.05），地衣芽孢桿菌三個批次發(fā)酵產 物 中 多 肽 含 量 分 別 為 （113.39±5.21）mg/g、（111.69±2.49）mg/g 和 （111.35±0.22）mg/g （P ＞0.05），產朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌作用花生粕3個批次所產花生多肽平均值分別為 （116.59±5.42）mg/g、（112.14±1.09）mg/g， 結果差異不顯著（P＞0.05）；其次，借助 SPSS 19.0分別分析了產朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌三個批次發(fā)酵結果的差異顯著性，結果發(fā)現(xiàn)，產朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌三個批次發(fā)酵結果均差異不顯著（P＞0.05），這說明就多肽的產量方面，產朊假絲酵母及地衣芽孢桿菌均可作為發(fā)酵菌種。但是，通過分析具體數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，產朊假絲酵母和地衣芽孢桿菌三個批次發(fā)酵產物中多肽含量從均勻性上看，地衣芽孢桿菌更佳；同時，產朊假絲酵母發(fā)酵產物氣味較地衣芽孢桿菌重（發(fā)酵味道更濃，中間夾雜一定的臭味），會影響發(fā)酵后花生粕作為飼料原料的適口性。而對于米曲霉，在試驗過程中出現(xiàn)生長不佳甚至不生長的情況，與初篩結果有較大差異。

綜上，選擇地衣芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種。

3 討論

3.1 基質的選擇 本試驗所用4個不同來源樣品粗蛋白質含量均在43%以上，主要原因是花生粕是花生榨油后的副產物，大部分油脂被脫去，脂肪含量明顯減少，蛋白質得到濃縮，因此花生粕（餅）作為一種高蛋白質原料生產多肽有較好的優(yōu)勢。

在粗脂肪含量方面，花生餅顯著高于花生粕，這主要與花生餅/花生粕的生產工藝有關。脂肪作為一種營養(yǎng)物質，可作為碳源和能源被很多微生物所利用，并可提供一定的生長因子，但是脂肪的降解不但需要有脂肪酶的存在，更需要比糖代謝更多的O2才能完全降解，不然大量的脂肪酸以及代謝中的有機酸的積累，會引起pH的顯著下降，導致微生物酶系統(tǒng)的作用以及微生物的正常生長代謝受到嚴重影響。因此當花生粕（餅）作為微生物的作用基質（培養(yǎng)基）時，尤其是在采用固態(tài)發(fā)酵形式的情況下，其粗脂肪含量不宜過高（王鏡巖等，2002）。

糖類是發(fā)酵培養(yǎng)基中應用最為廣泛的一種碳源，是促進微生物生長的一種速效碳源，因此花生粕（餅）中含有較高的總糖，有利于目標微生物的生長繁殖及代謝產物（酶）的產生，進而作用于基質中的蛋白質生成目標產物（多肽）。

綜合所述，來自于山東魯花的樣品由于具有較高的蛋白質和總糖含量，較低的脂肪含量，被選作為后續(xù)試驗的樣品。

3.2 各菌種對花生粕基質的作用效果 就粕類的發(fā)酵生產而言，菌種多采用以產蛋白酶、纖維素酶及糖化酶豐富的芽孢桿菌、霉菌等，并取得了較好的作用效果（明強強等，2014a；張友維，2012）。在本研究中，枯草芽孢桿菌并沒有表現(xiàn)出較佳的作用效果，究其原因可能是作為基質的花生粕的碳氮比為7.5∶1，而適合枯草芽孢桿菌生長的碳氮比在 2∶1左右（葉云峰等，2011），同時采用的固態(tài)發(fā)酵方式而導致的通氣不暢，使其生長較差，其豐富的酶系未大量分泌，只是將大分子的花生蛋白進行了初步降解，而降解成小肽（14 kD以下）的能力不足。

黑曲霉的作用效果與枯草芽孢桿菌類似，但比枯草芽孢桿菌更弱，尤其是產生小肽能力方面[（72.38±9.89）mg/g]，電泳圖譜顏色顯示更淺，并且其生長過程中產生大量黑色孢子，使發(fā)酵后花生粕顏色明顯變暗，嚴重影響產品外觀。

對于釀酒酵母，雖然含量測定 [（74.82±10.77）mg/g]及電泳圖譜均顯示其有大量的小肽產生，但是電泳圖譜同時顯示，花生粕大分子蛋白并未被大量降解，因此圖譜上顯示的小肽可能更多的是來至菌體產生的蛋白而不是降解所得。

植物乳酸桿菌由于需要厭氧的生長條件，在花生粕基質中幾乎無生長，多肽產量也與對照相近 [（22.81±5.84）mg/g]。 而對于米曲霉 （鄧靜等，2008；孫春華等，2007）、產朊假絲酵母（何東東，2010）和地衣芽孢桿菌（胡尚勤和劉天貴，2000），由于其最適生長基質C/N與花生粕較為相近，生長情況良好，并產生大量的蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶等酶類，降解花生粕并產生大量多肽。

4 結論

本試驗通過測定不同來源的花生粕（餅）的基本成分，確定了具有較高的粗蛋白質、總糖含量，較低的脂肪含量的樣品作為后續(xù)試驗的樣品。然后采用固態(tài)發(fā)酵技術，以花生多肽產量為考察指標，并通過SDS-PAGE試驗及產多肽穩(wěn)定性試驗，從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉、產朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳酸桿菌等7株菌株中篩選出多肽產量高、穩(wěn)定的地衣芽孢桿菌為目標發(fā)酵菌株。為后續(xù)優(yōu)化發(fā)酵工藝，提高多肽產量、品質及活性打下了良好基礎。

[1]鄧靜，吳華昌，吳明霞，等.米曲霉產蛋白酶條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2008，12：51～53.

[2]何東東.產朊假絲酵母的發(fā)酵及功能性質研究：[碩士學位論文][D].天津：天津商業(yè)大學，2010.

[3]胡尚勤，劉天貴.地衣芽孢桿菌營養(yǎng)要求的研究[J].河北省科學院學報，2000，17（4）：224～227.

[4]劉大川，周俊梅.富硒蛋白肽的物性研究[J].食品科學，2008，29（3）：84～86.

[5]劉大川.多肽的功能特性及其制備[J].糧食科技與經(jīng)濟，2013，38（3）：45～ 48.

[6]明強強，于麗娜，楊慶利，等.黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備花生蛋白肽及抗氧化活性研究[J].2014a，39（2）：17～22.

[7]史軍.花生蛋白酶解及活性肽抗氧化活性研究：[碩士學位論文][D].鄭州：河南工業(yè)大學，2007.

[8]孫春華，燕磊，常維山.不同碳源和氮源對米曲霉產酶影響的研究[J].西南農業(yè)學報，2007，20（5）：986～990.

[9]王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學[M].高等教育出版社，2002.

[10]葉云峰，黎起秦，袁高慶，等.枯草芽孢桿菌B47菌株高產抗菌物質的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學通報，2011，38（9）：1339～1346.

[11]張友維.枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究：[博士學位論文][D].無錫：江南大學，2012.

[12]Byun H G.Purication and characterization of angiotensin converting process[J].Biochemistry 2001，36（6）：1155～1162.

[13]Hwang J Y，Shyu Y S，Wang Y T，et al.Antioxidative properties of protein hydrolysate from defatted peanut kernels treated with esperase[J].LWTFood Science and Technology，2010，43（2）285～290.

[14]Sarmadi B H，Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins：A review[J].Peptides，2010，31（10）：1949～1956.

[15]Wahb K E.Glycyl-L-Sarcosine absorption across ovine omasal epithelium during coincubpafion with other pepfide substrated and violatil fatty acida[J].Journal of Animal Seience，1998（17）：2706～2771.