杜亞軍

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,太原030031）

0 引言

人體腸道菌群的微生態(tài)平衡與健康密切相關(guān)，腸道菌群包括益生菌和潛在致病菌[1]。人體腸道益生菌的數(shù)量隨年齡增大而逐漸減少，益生菌活菌制劑保存性差，活菌攝入機(jī)體后在腸道中難以定植，補(bǔ)充益生菌的效果降低，采用促進(jìn)益生菌增殖的物質(zhì)來(lái)提高體內(nèi)益生菌將是一條更易被接受的途徑[2]。近年來(lái)人們的注意力逐漸從生產(chǎn)益生菌活菌制劑向益生菌增殖因子的研究生產(chǎn)轉(zhuǎn)移[3]。

水溶性膳食纖維選擇性地刺激益生菌的生長(zhǎng)和活力，從而使益生菌增殖[4]。本項(xiàng)目研究低聚糖等多種水溶性膳食纖維對(duì)腸道益生菌選擇性促進(jìn)生長(zhǎng)作用，探討水溶性膳食纖維在調(diào)節(jié)人體微生態(tài)環(huán)境，提高免疫力、抗氧化、延緩衰老方面的保健功效。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與設(shè)備

無(wú)菌工作臺(tái)，YXQG02型電熱式蒸汽消毒鍋，HG101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱，HG303-3型電熱恒溫培養(yǎng)箱，HZS-HA水浴振蕩器，DZKW型電子恒溫水浴鍋，

CJJ-78型磁力電熱攪拌器，721型分光光度計(jì)，PHS-3C型精密pH計(jì)，BS110S電子分析天平。

1.1 水溶性膳食纖維原料及其培養(yǎng)液的制備

低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharid），燕麥β-葡聚糖（Oat branβ-glucan,實(shí)驗(yàn)室自制），瓜爾豆膠（Guar gan）,亞麻籽膠（Linseed gun）,果膠（Pectin）,甜菊糖（Stevioside）， 聚葡糖（Pdgdextrosel）。

水溶性膳食纖維培養(yǎng)液的制備：將各水溶性膳食纖維用蒸餾水溶解后配成一定濃度的溶液備用。

1.2 培養(yǎng)基

采用MRS培養(yǎng)基為雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基（配方見表1）[5]，MRS＃培養(yǎng)基為嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基為大腸桿菌增殖培養(yǎng)基。MRS＃培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加了促進(jìn)生長(zhǎng)物質(zhì)碳酸鈣質(zhì)量濃度20 g/L，其中葡萄糖質(zhì)量濃度為7.5 g/L。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的鑒別培養(yǎng)基為改良MRS固體培養(yǎng)基[6]，大腸桿菌的鑒別培養(yǎng)基為EMB固體培養(yǎng)基。改良MRS培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加了X-Gal（Amresco 0428）0.06 g/L（質(zhì)量濃度）。

1.3 方法

1.3.1 菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定

增殖液生長(zhǎng)量的測(cè)定采用濁度法,用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD值，雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌測(cè)定增殖液在660 nm的OD值，大腸桿菌測(cè)定增殖液在600 nm的OD值。

表1 MRS、MRS＃培養(yǎng)基組分 g·L-1

1.3.2 菌液PH值的測(cè)定

用PHS-3C型精密pH計(jì)在室溫下測(cè)定pH值。

1.3.3 計(jì)數(shù)方法

采用平板計(jì)數(shù)法。用無(wú)菌水將樣品稀釋至一定稀釋度，涂布平板，每個(gè)樣品涂布3個(gè)平板，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

每毫升培養(yǎng)液中的菌數(shù)=3個(gè)平板培養(yǎng)基菌落總數(shù)/3×10×培養(yǎng)液的稀釋倍數(shù)。

1.4 菌種及菌種的活化

兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）凍干菌種，由中國(guó)科學(xué)院微生物所引入。嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）凍干菌種，菌號(hào)ATCC6075,中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心購(gòu)買。大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）試管斜面菌種，由山西大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院引入。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種水溶性膳食纖維對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響

分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%的低聚糖、瓜爾豆膠、燕麥β-葡聚糖、亞麻籽膠、果膠、甜菊糖、和聚葡糖取代培養(yǎng)基葡萄糖，作為唯一的培養(yǎng)基碳源，不加水溶性膳食纖維和葡萄糖的相同培養(yǎng)基作為對(duì)照，樣品和對(duì)照進(jìn)行接種培養(yǎng)。在MRS培養(yǎng)基中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種雙歧桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測(cè)定雙歧桿菌的生長(zhǎng)量和pH值。在MRS＃培養(yǎng)基中以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種嗜酸乳桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測(cè)定嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)量和pH值。在LB培養(yǎng)基中以1%的接種量接種大腸桿菌，37℃水浴震蕩培養(yǎng)12 h后測(cè)定大腸桿菌的生長(zhǎng)量。結(jié)果表明，7種水溶性膳食纖維都對(duì)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌都有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，各種水溶性膳食纖維液的促進(jìn)生長(zhǎng)作用顯著性大小不同，作為培養(yǎng)基的唯一碳源，水溶性膳食纖維液濃度為0.75%時(shí)，對(duì)雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用顯著性大小排序如下：瓜爾豆膠＞亞麻籽膠＞燕麥β-葡聚糖＞果膠＞甜菊糖＞低聚異麥芽糖＞聚葡糖，雙歧桿菌的生長(zhǎng)量是對(duì)照的5.48～2.36倍。對(duì)嗜酸乳桿菌的促生長(zhǎng)作用顯著性大小排序如下：果膠＞瓜爾豆膠＞亞麻籽膠＞低聚異麥芽糖＞燕麥β-葡聚糖＞聚葡糖＞甜菊糖，嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)量是對(duì)照的3.79～1.61倍。除了添加燕麥β-葡聚糖、低聚異麥芽糖和聚葡糖的培養(yǎng)基，大腸桿菌生長(zhǎng)量略有增加外（分別是對(duì)照的1.53倍、1.38倍和1.22倍），其它水溶性膳食纖維培養(yǎng)基中大腸桿菌生長(zhǎng)量與對(duì)照相比沒有增加，水溶性膳食纖維對(duì)大腸桿菌沒有促生長(zhǎng)作用。各種水溶性膳食纖維對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響如表2所示。

2.2 水溶性膳食纖維對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響

2.2.1 對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)一：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維分別取代MRS培養(yǎng)基中葡萄糖，作為培養(yǎng)基的唯一碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)二：在MRS培養(yǎng)基中直接加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)基碳源為葡萄糖和水溶性膳食纖維）。以上培養(yǎng)基接入5%的雙歧桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測(cè)定其生長(zhǎng)量和pH值。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不論是否含葡萄糖，在一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，隨著水溶性膳食纖維液濃度的增加，雙歧桿菌生長(zhǎng)量也顯著增加，而pH值在逐漸減少。當(dāng)培養(yǎng)基碳源為葡萄糖和水溶性膳食纖維時(shí)（實(shí)驗(yàn)二），由于葡萄糖也可促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)，水溶性膳食纖維和葡萄糖對(duì)雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用互相疊加，隨著水溶性膳食纖維液濃度的增加，雙歧桿菌生長(zhǎng)量增加不如培養(yǎng)基碳源為葡萄糖實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)一）明顯，在水溶性膳食纖維液達(dá)到一定濃度時(shí)，隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用不再增加（如低聚異麥芽糖和聚葡糖）。水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響如表3和表4所示。

表2 各種水溶性膳食纖維對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響

2.2.2 水溶性膳食纖維濃度對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)一：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維分別取代MRS＃培養(yǎng)基的葡萄糖，作為培養(yǎng)基的唯一碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)二：在MRS＃培養(yǎng)基中直接加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)基碳源為2%葡萄糖和水溶性膳食纖維）；以上培養(yǎng)基接入5%的嗜酸乳桿菌，37℃靜置培養(yǎng)16 h后測(cè)定其生長(zhǎng)量和pH值。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不論是否含葡萄糖，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著水溶性膳食纖維液濃度的增加，嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)量也顯著增加，而pH值在逐漸減少。當(dāng)培養(yǎng)基碳源為葡萄糖和水溶性膳食纖維時(shí)（實(shí)驗(yàn)二），由于葡萄糖也可促進(jìn)嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)，水溶性膳食纖維和葡萄糖對(duì)嗜酸乳桿菌的促生長(zhǎng)作用互相疊加，隨著水溶性膳食纖維液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)量增加不如培養(yǎng)基碳源為葡萄糖實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)一）明顯，在水溶性膳食纖維液達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)嗜酸乳桿菌的促生長(zhǎng)作用不再增加（如甜菊糖）。水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響如表5和表6所示。

2.2.3 水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

在LB培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7種水溶性膳食纖維，接入1%大腸桿菌，37℃水浴震蕩培養(yǎng)12 h后測(cè)定其生長(zhǎng)量。結(jié)果表明，隨濃度的增加，水溶性膳食纖維對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)影響較小，生長(zhǎng)量增加不明顯，水溶性膳食纖維隨濃度增加，對(duì)大腸桿菌沒有促生長(zhǎng)作用。水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響如表7所示。

2.3 體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

將3種不同的腸道細(xì)菌菌株按同樣比例接種于同一瓶分別以7種水溶性膳食纖維為唯一碳源的MRS液體培養(yǎng)基中,混合培養(yǎng)16 h后取樣,分別測(cè)定益生菌和大腸桿菌的菌落數(shù)。有益菌的計(jì)數(shù)：樣品涂布改良MRS平板后，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。雙歧桿菌菌落為深藍(lán)色，菌落呈現(xiàn)圓型，較致密。嗜酸乳桿菌菌落為淺藍(lán)色，菌落扁平狀，邊緣不整齊，不透明。大腸桿菌的計(jì)數(shù)：樣品涂布EMB平板后，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，選擇具有金屬光澤的紫黑色菌落計(jì)數(shù)。

結(jié)果表明，益生菌在生長(zhǎng)中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，水溶性膳食纖維液濃度為0.75%時(shí)，7種水溶性膳食纖維培養(yǎng)液中，益生菌的菌落數(shù)都顯著高于大腸桿菌菌落數(shù)（見圖6），益生菌的菌落數(shù)比大腸桿菌高出103.57到101.59 mL-1（見表8），這說(shuō)明水溶性膳食纖維可選擇性促進(jìn)益生菌生長(zhǎng),益生菌的增殖又可對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)起一定的抑制作用。腸道益生菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)各菌的活菌數(shù)如表8和圖1所示。

3 討論

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：無(wú)論是作為培養(yǎng)基唯一的碳源或添加到含葡萄糖的培養(yǎng)基中，7種水溶性膳食纖維都對(duì)雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌有顯著促進(jìn)生長(zhǎng)作用，葡萄糖也可促進(jìn)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)，但葡萄糖到達(dá)結(jié)腸前，已大都被小腸吸收，不會(huì)被腸道益生菌所利用。7種水溶性膳食纖維對(duì)大腸桿菌沒有促生長(zhǎng)作用。競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)結(jié)果顯示：7種水溶性膳食纖維可顯著地促進(jìn)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)，而雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖又可對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定抑制作用。

表3 水溶性膳食纖維濃度對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

表4 水溶性膳食纖維濃度對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響

表5 水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)影響

表6 水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響

表7 水溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

表8 腸道益生菌和大腸桿菌混合培養(yǎng)各菌的活菌數(shù)（對(duì)數(shù)值）

圖1 混合培養(yǎng)各菌的活菌數(shù)（對(duì)數(shù)值）

水溶性膳食纖維進(jìn)入人體消化道后，由于缺少相關(guān)消化酶不能被吸收，幾乎未受影響直接進(jìn)入大腸。在大腸內(nèi)，益生菌通過(guò)分泌到胞外的糖苷酶將其降解，然后再吸收利用，這樣水溶性膳食纖維可作為益生菌的碳源，選擇性地刺激益生菌的生長(zhǎng)和活力，從而使益生菌增殖，而大腸桿菌對(duì)其不能利用或利用率很低。另一方面，水溶性膳食纖維作為益生菌發(fā)酵的底物，可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌在自身的代謝中也會(huì)產(chǎn)生乳酸等，這會(huì)使得腸道的pH值降低，腸道的酸性環(huán)境具有較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，能夠控制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。乳酸菌等在腸道產(chǎn)生的有機(jī)酸及細(xì)菌素，也可抑制大腸桿菌和腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)。

總之，水溶性膳食纖維促使益生菌大量增殖，形成微生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，直接抑制了外源性和腸內(nèi)固有腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，從而有益于發(fā)揮正常腸道菌在屏蔽、營(yíng)養(yǎng)、免疫上的正常功能，是一種良好的益生菌增殖因子。

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