楊彥榮,任艷,德亮亮,陳紅霞,張冬蕾,劉文俊,張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

0 引言

傳統(tǒng)發(fā)酵奶制品的制作與食用已有數(shù)千年的歷史，生產(chǎn)和消費(fèi)群體遍布世界各地[1]。其中奶酪又是乳中的精品，被譽(yù)為“乳業(yè)皇冠上的珍珠”。

大量的研究表明，以牛奶為原料通過(guò)傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)的新鮮奶酪制品中包含著豐富的微生物群落，微生物的組成是影響奶酪質(zhì)量的關(guān)鍵因素[2，3]。然而，有關(guān)俄羅斯地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的研究還相對(duì)較少，對(duì)其中微生物特別是乳酸菌的研究還不夠深入。

本研究以實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的方法，和16S rRNA基因序列分析方法對(duì)俄羅斯卡爾梅克地區(qū)奶酪的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，以期為傳統(tǒng)乳制品的品質(zhì)改良和優(yōu)良發(fā)酵劑菌種的篩選提供基礎(chǔ)知識(shí)和珍貴的乳酸菌資源。

1 引言

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

本研究的7份傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪樣品是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員于2012年8月～9月于俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)地區(qū)采集的。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基BD（DifocTMLactobacilli MRS Agar），MRS液體培養(yǎng)基（OXOID），M17液體培養(yǎng)基（OXOID），M17液體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂為M17固體培養(yǎng)基，M17培養(yǎng)基中添加2%葡萄糖和0.5%乳糖。

PBS：0.8%氯化鈉，0.02%磷酸二氫鉀，0.115%磷酸氫二鈉。

脫脂乳保護(hù)劑：10 g脫脂乳粉，0.1 g谷氨酸鈉，蒸餾水 90 mL（121℃，7 min滅菌，98℃急冷）。

提取DNA所用試劑：0.5 M EDTA，10%SDS，10 mol/L CTAB，TE緩沖液（pH8.0），酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，體積比），氯仿/異戊醇（24∶1，體積比），濃度為5 mol/L的NaCl，3 mol/L的NaAc，異丙醇，乙醇，蛋白酶K（Proteinase K）、核糖核酸酶A（RnaseA）。

PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)所用試劑：Easy Taq DNA聚合酶、10×Easy Taq PCR緩沖液（Mg2+）、高純度dNTPs（每種2.5 mmol/L）、5×TBE電泳緩沖液貯液、0.8%～1.2%的瓊脂糖凝膠、核酸染料GELVIEW（北京百泰克）、λ DNA/Hind III Marker和QDL2,000 Quantitative DNA Marker。以上配制試劑所用的化學(xué)藥品均為天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑公司的產(chǎn)品，為分析純。上述酶類和Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司和大連寶生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）。由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 設(shè)備

JT102N電子天平，HIRAYAMA HA-300M全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器，ADVANTEC SP-650全自動(dòng)高壓干熱滅菌器，ZHJH-C1214C雙人雙面超凈工作臺(tái)，OLYMPUS BX50光學(xué)顯微鏡及OLYMPUS PM-2攝像系統(tǒng)，LABC0NC0LL-6SFPY真空冷凍干燥機(jī)，EYELA WFO-400濃縮干燥系統(tǒng)，MIR-1620型電熱恒溫培養(yǎng)箱，ZHWY-200D型水平搖床，HHS 1-Ni電熱恒溫水浴鍋，Eppendorf TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī)，Eppendorf 5810高速冷凍離心機(jī)，MJ RESEARCH PTC-200梯度基因擴(kuò)增儀，DYY-12電泳儀，UVPGDS-8000凝膠成像儀，ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

本研究在采集樣品時(shí)直接用無(wú)菌勺取5.0 g左右樣品放入裝有0.5 g滅菌中和劑（淀粉/CaCO3，50∶1，質(zhì)量比）的無(wú)菌螺口凍存管中，混勻后用封口膜封口后標(biāo)記樣品號(hào)。將采集的所有樣品放入4℃便攜式冰箱內(nèi)保持低溫度狀態(tài)，帶回實(shí)驗(yàn)室后，盡快進(jìn)行微生物組成分析和乳酸菌的分離實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌的組成分析、分離純化與保存

乳酸菌計(jì)數(shù)：采用傾注法。將樣品用漩渦振蕩器混勻，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的無(wú)菌生理鹽水以10倍稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別選取稀釋度為10-5，10-6，10-7的稀釋液1 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，與MRS和M17平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基混勻，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置厭氧培養(yǎng)48 h。然后計(jì)數(shù)即為每毫升樣品的菌落數(shù)[4]。

將上述梯度為10-4，10-5，10-6的稀釋液分別涂布于含有0.01%（體積份數(shù)）放線菌酮的無(wú)菌MRS和M17固體培養(yǎng)基上，30厭氧培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)學(xué)特征不同的單個(gè)菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。選取過(guò)氧化氫陰性、革蘭氏陽(yáng)性的純培養(yǎng)物，加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%谷氨酸鈉的脫脂乳保護(hù)劑，分裝于無(wú)菌安瓿管中和凍存管中于-80℃保存，備用[5]。

1.2.3 乳酸菌鑒定

（1）基因組DNA提取與純度檢測(cè)。純化好的菌株用CTAB法和凍融法相結(jié)合提取基因組DNA[6-7]。使用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度。

（2）16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增16S rRNA引物采用通用引物，正向引物為FA-27F（GCAGAGTTCTCGGAGTCA CGAAGAGTTTGAT CCTGGCTCAG）；反向引物為 RA-1495R（AGCGGATCACTTC ACACAGGACTACGGCTACCTTGT TACGA）[8]。由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增片段約為1 450 bp。取2 μL產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為0.1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增體系：5 μ L 10×Easy Taq Buffer（+Mg2+）；4 μ L High Pure dNTPs（濃 度 2.5 mmol/L）；1.5 μL引物FA-27F（濃度10 mmol/L）；1.5 μ L引物 RA-1495R（濃度 10 mmol/L）；0.5 μLEasyTaq DNA polymerase（5U/μL）；2 μLDNA模板（質(zhì)量濃度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸10 min[9]。

擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取約2 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若在1 500 bp處有清晰的擴(kuò)增條帶且無(wú)拖尾、彌散現(xiàn)象，則PCR擴(kuò)增成功。

（3）16S rRNA序列測(cè)定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將檢測(cè)后片段長(zhǎng)度約為1500 bp的陽(yáng)性產(chǎn)物直接送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。采用DNAStar 5.01軟件中的SepMan模塊，對(duì)所測(cè)得菌株的兩條16S rRNA基因序列進(jìn)行整理、拼接、校準(zhǔn)，得到1 450 bp左右的有效序列，于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)鑒定[10]，尋找同源性最高的已知分類學(xué)地位的菌種。

利用軟件Mega5中的Neighbor-joining法對(duì)37株乳酸菌作系統(tǒng)進(jìn)化樹,比較了它們之間的進(jìn)化距離[5，11]。

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的計(jì)數(shù)

俄羅斯地區(qū)樣品中乳酸菌的計(jì)數(shù)結(jié)果如表1所示。

表1 俄羅斯卡爾梅開共和國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪樣品中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果（n=3，±SD）

表1 俄羅斯卡爾梅開共和國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪樣品中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果（n=3，±SD）

樣品編號(hào)Ru 4 Ru 5 Ru 6 Ru 24 Ru 26 Ru 30 Ru 39采樣地俄羅斯卡爾梅克共國(guó)亞什庫(kù)爾鎮(zhèn)亞什庫(kù)爾鎮(zhèn)亞什庫(kù)爾鎮(zhèn)亞什庫(kù)爾鎮(zhèn)嘎西貢亞什庫(kù)爾鎮(zhèn)嘎西貢伊科朝納斯沃茲涅謝諾夫卡乳酸菌數(shù)（對(duì)數(shù)值）/mL-1 8.92±0.01 7.50±0.23 8.19±0.03 7.16±0.01 6.64±0.02 9.05±0.03 8.43±0.02

由表1可以看出，奶酪樣品中乳酸菌數(shù)為6.64～9.05 mL-1，平均值為（7.98±0.91）mL-1。研究結(jié)果和Bao Qiuhua對(duì)甘肅牦牛乳曲拉和四川曲拉的研究結(jié)果相近。其平均乳酸菌數(shù)分別為（7.9±0.89）mL-1[12]和（7.18±1.49）mL-1[4]。曲拉又稱粗奶酪，與奶酪生產(chǎn)工藝相似。

3.2 乳酸菌的鑒定

3.2.1 菌種DNA提取和16S rRNA擴(kuò)增

DNA濃度和OD260/280的測(cè)定：OD260/280值在1.8～2.0間即為純DNA樣品。將其質(zhì)量濃度稀釋至100 ng/μL后進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增。

對(duì)乳酸菌分離株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，可以觀察到在大約1 500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，并且無(wú)彌散現(xiàn)象，無(wú)明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。

這表明菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物可以滿足測(cè)序的要求。將16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物送于上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。所有的16S rDNA序列都與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株有99%及以上的相似度，根據(jù)前人的研究，16S rRNA用于鑒定乳酸菌有很高的可靠性。

3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌鑒定

將測(cè)序獲得的16S rRNA基因序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，以與模式菌株序列同源性大于98%為種的鑒定閾值，將17株分離株鑒定為乳酸菌的3個(gè)屬，20個(gè)種。分離株與模式株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

由圖1可以看出，菌株IMAU90028，IMAU90029，IMAU90030，IMAU90032，IMAU90034，IMAU90046，IMAU90048，IMAU90065，IMAU90088，IMAU90150，IMAU90209與標(biāo)準(zhǔn)菌株 Lactobacillusplantarum ATCC14917聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum。菌株IMAU90033、IMAU9 0066與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus brevis ATCC14869聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus brevis。菌株IMAU90215與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus kefiri LMG9480聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus kefiri。菌株IMAU90047與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus graminis DSM20719聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus graminis。菌株IMAU90086，IMAU90087，IMAU90091，IMAU90094，IMAU90210，IMAU90214與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus paracasei ATCC25302聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒 定 為 Lactobacillus paracasei。 菌 株 IMAU90176、IMAU90174與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcusdurans ATCC19432聚為一類，且同源性為70%，故將其鑒定為Enterococcus durans。菌株IMAU90155、IMAU9015 6、IMAU90157、IMAU90158、IMAU90212、IMAU9021 3與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcus faecium ATCC 19434聚為一類，且同源性為99%，故將其鑒定為Enterococcus faecium。 菌 株 IMAU90067，IMAU90090，IMAU90092，IMAU90093，IMAU90151，IMAU90211與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus helveticus DSM20075聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus helveticus。菌株IMAU90177與標(biāo)準(zhǔn)菌株Leuconostoccitreum ATCC49370聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為L(zhǎng)euconostoc citreum。菌株IMAU90178與標(biāo)準(zhǔn)菌株Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC1777聚為一類，且同源性為69%，故將其鑒定為L(zhǎng)euconostoc pseudomesenteroides。

圖1 分離株與其相應(yīng)模式株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

所有分離株鑒定結(jié)果和種屬統(tǒng)如表2所示：

本研究的奶酪樣品中乳酸菌的優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng)actobacillus plantarum（29.7%），其次分離株數(shù)較多的是Lactobacillus paracasei（16.2%）、Lactobacillus helveticus（16.2%）、Enterococcus faecium（16.2%）。不同地區(qū)的奶酪樣品中優(yōu)勢(shì)菌群是不同的：Aydemir等所研究的奶酪中優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus casei和Lactobacillus plantarum[13]；Dolci等的研究中Lactobacillus plantarum和Lactobacillus paracasei是Castelmagno PDO奶酪中的優(yōu)勢(shì)菌[14]；Coppola R等的研究中Caciocavallo奶酪的優(yōu)勢(shì)菌為L(zhǎng)actobacillus paracasei subsp.Paracasei、Lb.pentosus,Lb.coryneformis subsp.Torquens和 Lb.plantarum.[15]；Coppola S等的研究中Mozzarella奶酪的優(yōu)勢(shì)菌為Strep.thermophilus[16]；還有的為 Lactobacillus paracasei、Lactobacillus fermentum和Lactobacillus plantarum[17]。不同環(huán)境自然發(fā)酵的奶酪中優(yōu)勢(shì)菌群是不同的，我們所分離到的Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei在奶酪中也是比較常見(jiàn)的。

表2 乳酸菌分離株與模式菌株同源性比對(duì)結(jié)果

4 結(jié)論

7份奶酪樣品中乳酸菌數(shù)為6.64～9.05 mL-1（對(duì)數(shù)值），乳酸菌含量都比較高。7份奶酪樣品中共分出37株菌，分別屬于腸球菌屬、乳桿菌屬、明串株菌屬，共3個(gè)屬10個(gè)種。乳球菌10株，乳桿菌27株。本研究可以為俄羅斯卡爾梅克地區(qū)傳統(tǒng)奶酪中乳酸菌多樣性研究提供原始數(shù)據(jù)，也可以為以后的乳酸菌篩選與工業(yè)生產(chǎn)提供菌株資源。

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