牛奶中β-內(nèi)酰胺酶來源及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展

陳美霞 ，文芳 ，鄭楠 ，楊晉輝 ，張勇 ，陳璐

（1.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），北京100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

0 引言

近些年，牛奶抗生素殘留成為奶及奶制品質(zhì)量安全的一個(gè)重點(diǎn)問題。因?yàn)棣?內(nèi)酰胺酶可使β-內(nèi)酰胺類抗生素降解，導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)破壞或功能喪失，從而可避免牛奶中殘留抗生素的檢出[1]。因此，不法商家人為地向奶中添加β-內(nèi)酰胺酶使抗生素降解，避免抗生素的檢出。β-內(nèi)酰胺酶的添加不僅掩蓋了抗生素殘留的事實(shí)，同時(shí)引入了抗生素降解產(chǎn)物及β-內(nèi)酰胺酶殘留所帶來的風(fēng)險(xiǎn)[2]。為了規(guī)范奶產(chǎn)品安全生產(chǎn)及奶制品質(zhì)量安全，我國(guó)已將β-內(nèi)酰胺酶列入非食用添加劑名單并要求進(jìn)行全國(guó)監(jiān)測(cè)。本文從牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的原因、現(xiàn)狀、風(fēng)險(xiǎn)及檢測(cè)方法等方面進(jìn)行綜述，為β-內(nèi)酰胺酶研究提供參考。

1 β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)與功能

β-內(nèi)酰胺酶，英文名稱為β-Lactamase，是細(xì)菌代謝過程產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，可特異性分解β-內(nèi)酰胺類抗生素。目前發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的β-內(nèi)酰胺酶有200多種。根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的等電點(diǎn)、結(jié)構(gòu)、水解產(chǎn)物、是否受克拉維酸抑制等，可以將β-內(nèi)酰胺酶分為五大類：（I）CEP-N 酶（頭孢菌素酶），（II）PEN-Y 酶（青霉素酶），（III）BSD-Y 酶（廣譜酶），（IV）EBS-Y 酶即 ESBLS（超廣譜酶），（V）金屬酶（金屬β-內(nèi)酰胺酶）[3]。β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素的作用主要有水解和非水解兩種方式[4]。大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶的活性位點(diǎn)具有一個(gè)縱行溝狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)疏松易彎曲，利于底物的結(jié)合。抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳可以不可逆的結(jié)合在該活性位點(diǎn)處的絲氨酸上，使抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)解開，造成抗生素降解，避免抗生素的檢出。另外一些抗生素如金屬酶，它們是利用二價(jià)金屬離子與組氨酸或半胱氨酸結(jié)合，并與抗生素羰基中的酰胺鍵相互作用，抑制抗生素發(fā)揮作用，避免抗生素的檢出。目前國(guó)際上研究比較活躍的是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶。

2 β-內(nèi)酰胺酶殘留的風(fēng)險(xiǎn)

2.1 β-內(nèi)酰胺酶在牛奶中殘留的內(nèi)源性因素

研究表明，許多微生物可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶[5]。其中，革蘭氏陽性菌可以產(chǎn)生青霉素酶和頭孢素酶2種β-內(nèi)酰胺酶；而革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶卻種類繁多，截至目前，已報(bào)道有200多種。目前關(guān)于牛體內(nèi)或牛奶內(nèi)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的微生物是否會(huì)造成牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留主要存在以下兩種觀點(diǎn)。

高延玲等[6]及謝磊等[7]認(rèn)為微生物產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶在牛奶中殘留率比較高。2010年高延玲等[6]在已查明無人為β-內(nèi)酰胺酶添加的情況下對(duì)140批生鮮乳進(jìn)行檢測(cè)，β-內(nèi)酰胺酶檢出率達(dá)52.9%。與之類似，2014年謝磊等[7]對(duì)北京市10家養(yǎng)殖場(chǎng)的593份生鮮乳進(jìn)行分析，內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶殘留陽性檢出率達(dá)28.7%。這可能與貯存時(shí)間延長(zhǎng)、抗菌藥物不合理使用等因素促進(jìn)細(xì)菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶增加有關(guān)[6-7]。

然而，張?chǎng)螢t等[2]及劉琴等[8]認(rèn)為在無外源β-內(nèi)酰胺酶添加的情況下，微生物產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶殘留量及殘留率很低，幾乎無法檢測(cè)到。他們分析可能是牛奶采集方式、牛奶成分、消毒方法、包裝儲(chǔ)存方式等情況不適合產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的微生物生存。因此，張?chǎng)螢t等[2]及劉琴[8]等認(rèn)為基于目前的認(rèn)識(shí)和實(shí)踐，牛奶中檢出的β-內(nèi)酰胺酶是外源性添加的。

2.2 β-內(nèi)酰胺酶在牛奶中殘留的外源性因素

β-內(nèi)酰胺類抗生素因其抗菌譜廣、價(jià)格便宜廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，如治療乳房炎及其他細(xì)菌感染等疾病[9-11]。但是由于使用不當(dāng)，如濫用、誤用尤其是不按說明經(jīng)過休藥期處理等原因，出現(xiàn)了牛奶中抗生素殘留的問題[12-13]。由于抗生素存在的普遍性，國(guó)家出臺(tái)相應(yīng)法規(guī)要求牛奶中抗生素“不得檢出”，并要求對(duì)所有生鮮乳進(jìn)行抗生素含量檢測(cè)，超標(biāo)者不得出售。因此，不法商家便在牛奶中添加抗生素降解劑，避免“有抗奶”的檢出。崔生輝等[14]、Guay等[15]通過實(shí)驗(yàn)證明這些“抗生素分解劑”的主要成分正是β-內(nèi)酰胺酶。另外，由于國(guó)內(nèi)大多數(shù)乳品企業(yè)對(duì)抗生素超標(biāo)的牛奶采用降價(jià)收購(gòu)的政策，使得1噸“有抗奶”和“無抗奶”價(jià)格相差近千元。在利益的驅(qū)動(dòng)下，不法商家會(huì)在牛奶中添加抗生素降解劑生產(chǎn)人造“無抗奶”[1]，從而導(dǎo)致牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的殘留。同時(shí)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，純化β-內(nèi)酰胺酶的工藝已經(jīng)非常成熟，目前具有一定生產(chǎn)規(guī)模的β-內(nèi)酰胺酶生產(chǎn)廠家不少于30家[2]。

雖然微生物可以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，可能在牛奶中殘留。但是，目前對(duì)市場(chǎng)和消費(fèi)者危害最大的并不是內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶，而是人為添加的β-內(nèi)酰胺酶。甚至有人認(rèn)為，正是這些外源性降解劑的添加使得假“無抗奶”大量充斥市場(chǎng)。

2.3 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的風(fēng)險(xiǎn)

雖然目前還沒有關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶殘留實(shí)際危害的報(bào)道，但是，牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)人體健康及奶業(yè)健康發(fā)展而言存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。

以青霉素為例，約74%的病人對(duì)其過敏。究其機(jī)理，一方面，青霉素降解產(chǎn)物——青霉素噻唑酸可與蛋白結(jié)合形成抗原導(dǎo)致過敏；另一方面，青霉素在內(nèi)部β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)后會(huì)高度聚合形成高聚物導(dǎo)致過敏[2]。而郭宗儒等[16]及彭司勛等[17]指出，β-內(nèi)酰胺酶可催化青霉素開環(huán)生成青霉素噻唑酸。因此，從原理上講，β-內(nèi)酰胺酶有引起人體過敏的風(fēng)險(xiǎn)。另外，因?yàn)棣?內(nèi)酰胺酶分解其他β-內(nèi)酰胺類抗生素的降解產(chǎn)物中有許多是抗生素的類似物，而其分解物的危害尚不清楚，因此長(zhǎng)期飲用含β-內(nèi)酰胺酶處理的牛奶，也存在使人產(chǎn)生耐藥性、降低對(duì)傳染病的抵抗能力的風(fēng)險(xiǎn)[2]。另外，濫用解抗劑可能會(huì)引入其他的致病菌、致癌物質(zhì)，長(zhǎng)期飲用解抗劑處理的奶對(duì)身體的傷害不言而喻。

同時(shí)，不法商家添加以β-內(nèi)酰胺酶為主要成分的解抗劑來掩蓋抗生素使用的事實(shí)，擾亂市場(chǎng)，不利于我國(guó)奶業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

2.4 β-內(nèi)酰胺酶在牛奶中的殘留現(xiàn)狀

2007年崔生輝等[14,18]對(duì)市售的38份牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，60%以上樣品呈β-內(nèi)酰胺酶陽性。2010年高延玲等[6]對(duì)42個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖小區(qū)的140批生鮮乳進(jìn)行檢測(cè)，β-內(nèi)酰胺酶檢出率達(dá)52.9%。2012年寧波市公布的《2012年下半年寧波市乳制品評(píng)價(jià)性抽檢結(jié)果通報(bào)》中顯示該市出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心對(duì)608批次奶及奶制品進(jìn)行檢測(cè)，β-內(nèi)酰胺酶呈陽性的達(dá)40批次。2013年農(nóng)業(yè)部對(duì)西部地區(qū)某省異地抽檢時(shí)發(fā)現(xiàn)12份樣品中唯一一份不合格的原因便是β-內(nèi)酰胺酶超標(biāo)[19]。2014年謝磊等[7]對(duì)北京市10家養(yǎng)殖場(chǎng)共計(jì)593份生鮮乳進(jìn)行檢測(cè)，有28.7%的樣品呈β-內(nèi)酰胺酶陽性。

不管這些檢出的β-內(nèi)酰胺酶是內(nèi)源性還是外源性造成的，如此高的檢出率足以說明牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的嚴(yán)重性，說明β-內(nèi)酰胺酶的問題不容小覷。這警示我們需要加強(qiáng)牛場(chǎng)牛奶衛(wèi)生、運(yùn)輸以及儲(chǔ)存、市場(chǎng)銷售流通等各環(huán)節(jié)的管理，減少牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的殘留。

3 β-內(nèi)酰胺酶主要檢測(cè)方法

3.1 微生物法

微生物法是在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶使用比較廣泛、發(fā)展最早的一種方法。它的原理是選擇對(duì)抗生素敏感的細(xì)菌為指示劑，根據(jù)抑菌圈的大小判斷酶的多少。主要有顯色培養(yǎng)法[20]、三維試驗(yàn)法[21]、紙皮擴(kuò)散法[22]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法[23]、杯碟法[24]等。其中最為常用的是杯碟法（表1）。

2014年李欣南等[28]針對(duì)微生物法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶中常用的杯碟法的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)進(jìn)行了梳理，為實(shí)際檢測(cè)工作提供參考。

雖然目前實(shí)驗(yàn)室中微生物法使用比較廣泛，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合現(xiàn)場(chǎng)及快速檢測(cè)工作。

3.2 碘量法

碘量法也是目前比較常用的一種檢測(cè)方法。它是基于β-內(nèi)酰胺酶分解抗生素后的降解產(chǎn)物與碘發(fā)生氧化還原反應(yīng)進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的方法。中華人民共國(guó)藥典（2005版）中推薦使用碘量法對(duì)青霉素酶活性進(jìn)行檢測(cè)[29]。同時(shí)，目前市場(chǎng)上許多快速檢測(cè)試劑盒也是基于碘量法進(jìn)行的設(shè)計(jì)。

Sykes等[30]和Novick等[31]利用碘量法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)15～20 min后酶將抗生素完全降解后產(chǎn)生的吸光度值的變化進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶的定量，該方法檢測(cè)限為0.001 U?；诘饬糠ㄩ_發(fā)的優(yōu)爾齊TMβ-內(nèi)酰胺酶殘留定性及定量檢測(cè)試劑盒，定量檢測(cè)限為1 U/mL，借助酶標(biāo)儀30 min內(nèi)即可出檢測(cè)結(jié)果[32]。張?chǎng)螢t等發(fā)現(xiàn)碘量法可用于生鮮奶及奶制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，但是檢測(cè)限比較高[2]。2010年謝巖黎等[33]的研究表明當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度大于30 U/mL時(shí)，可通過直接碘量法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行定性分析，通過間接滴定法進(jìn)行定量分析。

表1 杯碟法在檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用

碘量法在β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)工作中使用比較廣泛，目前也有幾款基于碘量法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的試劑盒面市，適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)及大批量篩選工作；但是某些方法檢測(cè)限較高，需降低檢測(cè)限，提高靈敏度。

3.3 酸定量法

酸定量法的原理是β-內(nèi)酰胺類抗生素在β-內(nèi)酰胺酶的作用下分解，生成酸性產(chǎn)物引起牛奶pH發(fā)生變化，使相應(yīng)指示劑變色或使碳酸鹽溶液釋放二氧化碳引起壓力變化，通過pH計(jì)測(cè)量牛奶pH變化、觀察指示劑變色或壓力測(cè)量計(jì)測(cè)定壓力變化等手段實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的定量。

1947年Henry等[34]利用青霉素酶分解青霉素產(chǎn)生酸性產(chǎn)物青霉素噻唑酸引起二氧化碳釋放導(dǎo)致壓力變化的原理，通過壓力測(cè)量計(jì)定量二氧化碳的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定量檢測(cè)。2005年張春輝等[35]以酚酞為指示劑，通過酸定量法對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株進(jìn)行選擇，陽性率達(dá)97%。朱融融等[36]通過雙pH計(jì)同時(shí)檢測(cè)建立了牛奶中青霉素酶的檢測(cè)方法，檢出線性范圍為0.5～3.5 U，檢出限為0.4 U。2009年馬潔等[37]通過利用酸度計(jì)檢測(cè)牛奶pH的變化,實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定量，該方法在牛奶中的檢測(cè)限為15 U/mL，同時(shí)得到β-內(nèi)酰胺酶米氏常數(shù)為0.0351 mmol/L。

根據(jù)壓力變化測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶的酸定量法因費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜、影響因素較多、所需設(shè)備復(fù)雜等原因在實(shí)際中很少用到；而用pH計(jì)測(cè)定的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果重復(fù)性也比較好，但是可能會(huì)出現(xiàn)假陽性和假陰性的情況。因此，酸定量法在實(shí)際檢測(cè)工作中使用并不廣泛。

3.4 頭孢菌素顯色法

頭孢菌素顯色法原理是顯色頭孢菌素在β-內(nèi)酰胺酶的作用下解環(huán)降解，顏色發(fā)生改變表征β-內(nèi)酰胺酶的存在及含量。

1972年Callaghan等[38]結(jié)合其之前（1967）[39]的實(shí)驗(yàn)方法，選擇頭孢硝噻吩為顯色頭孢菌素，通過檢測(cè)顏色的變化定性、定量多種材料中的β-內(nèi)酰胺酶。其中定性方法方便易行，可在1 min內(nèi)判斷結(jié)果；定量方法用紫外分光光度計(jì)就可以完成，檢出限為10 μg/mL。但是該方法可能會(huì)因頭孢硝噻吩與蛋白結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。1980年Schindler等[40]發(fā)現(xiàn)4-2-吡啶偶氮-N，N-二甲氧基苯胺（PADAC）可以用于檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)該酶菌株的選擇，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的分析。1982年Jorgensen[41]等以PADAC為顯色頭孢菌素，通過檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的選擇，發(fā)現(xiàn)PADAC可以有效的用于嗜血桿菌和淋球菌產(chǎn)生的大量Ⅲ型β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)，但是對(duì)腸桿菌、克雷伯氏菌、擬桿菌及葡萄球菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)不靈敏，而頭孢硝噻吩對(duì)后者產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)更為靈敏。1987年Guay[15]等發(fā)現(xiàn)氯汞苯甲酸（pCMB）可以屏蔽牛奶中內(nèi)源性的β-內(nèi)酰胺酶，并用PADAC作為顯色頭孢菌素。因?yàn)镻ADAC不與蛋白質(zhì)結(jié)合，所以可以實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶更加靈敏的檢測(cè)。另外,2010年陳號(hào)等[42]通過重復(fù)Callaghan等（1972）的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)20 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中20 U/mLβ-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，但是，定量方法沒有重復(fù)出來。

雖然用頭孢菌素顯色法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的研究及報(bào)道較早，但是因該方法需要使用特殊的頭孢菌素，價(jià)格比較昂貴，所以在實(shí)驗(yàn)室中使用頻率不高。

3.5 現(xiàn)代儀器檢測(cè)法

高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等因其分離效率高、分析速度快、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于食品中危害因子的檢測(cè)，并有許多危害物質(zhì)檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)陸續(xù)出臺(tái)。

2008年林楠等[43]利用高效液相色譜儀檢測(cè)牛奶中青霉素被β-內(nèi)酰胺酶降解的產(chǎn)物青霉素噻唑酸，以此來判斷β-內(nèi)酰胺酶的存在與含量，在牛奶中的檢測(cè)限為4 U/mL，只需30 min即可出檢測(cè)結(jié)果。2009年衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批）》中關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院食品安全所推薦使用液相色譜法。同年，韓奕奕等[44]對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)表明，SNAP雙流向酶聯(lián)免疫間接檢測(cè)法對(duì)β-內(nèi)酰胺酶加標(biāo)試樣的檢出限可以達(dá)到0.001 IU/mL。2010年孫漢文等[45]利用快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（RRLC-MS/MS）檢測(cè)添加β-內(nèi)酰胺酶后氨芐青霉素的酶解率實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定性和定量，牛奶中檢測(cè)限為4 U/mL。2010年Xu等[46]開發(fā)了一種依賴基質(zhì)輔助激光解吸/電離傅立葉變換質(zhì)譜（MALDI-FTMS）的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法，該法是通過檢測(cè)青霉素被β-內(nèi)酰胺酶降解后的產(chǎn)物青霉素噻唑酸來實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定量。牛奶中檢測(cè)限為0.006 U/mL。2015年Zhou等[47]開發(fā)了一種檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的HPLC方法，該法通過HPLC檢測(cè)與β-內(nèi)酰胺酶孵育后剩余的青霉素G的量間接實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定量及活性檢測(cè)，牛奶中檢測(cè)限為0.6 U/mL。

現(xiàn)代儀器檢測(cè)法可對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行高通量定量檢測(cè)，故常可用于實(shí)驗(yàn)室定量分析，但是因?yàn)樾枰獙ｉT人員進(jìn)行操作、前處理比較復(fù)雜、所需設(shè)備比較昂貴等原因，在一些小實(shí)驗(yàn)室使用頻率不高，且不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3.6 生物傳感器法

生物傳感器由生物活性物質(zhì)（如核酸、抗原、抗體、酶、完整細(xì)胞等等）構(gòu)成的生物功能敏感原件，配合適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換器組合而成。工作原理是待測(cè)物質(zhì)進(jìn)入生物傳感器并與之部分或全部原件發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生一定的物理信號(hào)（如顏色、電、熱、光等）經(jīng)特定方法或轉(zhuǎn)化器轉(zhuǎn)換成可定量或可處理的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的定性或定量。

2007年Liu等[48]利用納米金材料設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的傳感器，可利用比色法實(shí)時(shí)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的活性。2010年Rubtsova等[49]開發(fā)了一種基于辣根過氧化酶設(shè)計(jì)的寡核苷酸微陣列，可用于臨床光譜β-內(nèi)酰胺酶的常規(guī)檢測(cè)。2013年Zhou等[50]開發(fā)了一種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的溫度生物傳感器，該傳感器的原理是加入定量的青霉素G與β-內(nèi)酰胺酶孵育，取混合液注入溫度傳感器系統(tǒng)中，根據(jù)溫度變化得出青霉素G的量，最后根據(jù)未反應(yīng)的青霉素G的量實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定量。該方法檢測(cè)限為1.1 U/mL。2014年Li等[51]開發(fā)了一種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的近紅外熒光探針，該探針是將特定的頭孢菌毒固定在半菁骨架上制作而成，該探針本身信號(hào)很弱，但在β-內(nèi)酰胺存在的情況下與之反應(yīng)，釋放熒光基團(tuán)使信號(hào)顯著升高，根據(jù)信號(hào)變化實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定量，該方法在牛奶中檢測(cè)限為0.02 nmol/L。

生物傳感器通常具有體積小、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、抗干擾能力強(qiáng)、響應(yīng)快及可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，因此近些年研究較熱。目前已有多款基于傳感器原理設(shè)計(jì)的試劑盒或試紙條面市，可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。

3.7 其他

1996年Liang等[52]在研究β-內(nèi)酰胺類抗生素時(shí)指出可以利用電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)生物基質(zhì)中的β-內(nèi)酰胺酶。2002年Hujer[53]等通過構(gòu)建對(duì)SHV-1和CMY-2型β-內(nèi)酰胺酶特異性的多克隆抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析（ELISAs），發(fā)現(xiàn)該方法至少可以對(duì)95%的SHV及AmpC型β-內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)靈敏、特異性地檢測(cè)，并可以對(duì)實(shí)驗(yàn)室及臨床分離出的β-內(nèi)酰胺酶實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量分析。2009年河南省獸藥監(jiān)察所發(fā)明了一種生鮮奶及奶制品中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)試劑盒，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)[54]。2013年Wang[55]等基于最優(yōu)化的單克隆抗體開發(fā)了一種檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的雙抗體酶聯(lián)免疫方法，在牛奶中檢測(cè)限達(dá)4.17 ng/mL。

雖然這些方法沒有具體分類且使用頻率不高，但仍可以用于β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。并且這些方法可以與其他方法結(jié)合，有望生產(chǎn)出適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的快速、高靈敏檢測(cè)產(chǎn)品。

4 結(jié)束語

目前針對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法有許多，如微生物法、碘量法、酸定量法、頭孢菌素顯色法、現(xiàn)代儀器檢測(cè)法、生物傳感器法及其它法等。但沒有一款集靈敏度、便攜性、高通量、易操作、經(jīng)濟(jì)于一身的方法，更沒有一款這樣的產(chǎn)品面市。另外，目前絕大多數(shù)方法是基于牛奶中總的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)，無法區(qū)分內(nèi)、外源β-內(nèi)酰胺酶。因此，建立一種可區(qū)分內(nèi)、外源性β內(nèi)酰胺酶，同時(shí)又可高通量、高靈敏的、方便快捷的β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。

[1]孟靜,王銳,祝建華.生鮮牛乳中抗生素檢測(cè)方法的新問題[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010（9）：42-44.

[2]張?chǎng)螢t,謝巖黎,王金水,等.牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)乳品工業(yè),2011.39（2）：45-47.

[3]劉珊珊.牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2011：3.

[4]邢旺興.β-內(nèi)酰胺酶的基本特性及其檢驗(yàn)方法[M].國(guó)外醫(yī)藥.抗生素分冊(cè),1995.39（1）：53-55.

[5]SAMAHA-KFOURY J N,ARAJ G F.Recent developments in β lactamases and extended spectrumβlactamases[J].BMJ：British Medical Journal,2003，327（7425）：1209.

[6]高延玲，劉宏偉，班付國(guó)，等.生鮮奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留情況調(diào)查及來源分析[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2010.6：20-21.

[7]謝磊,吉鴻武,劉建華,等.北京市生鮮牛乳中內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶殘留現(xiàn)狀研究[J].中國(guó)乳業(yè),2015（2）：51-56.

[8]劉琴.我國(guó)牛奶中抗生素殘留現(xiàn)狀分析及對(duì)策[J].當(dāng)代畜牧,2005（6）：1-2.

[9]ROGINSKI H,FUQUAY J W,FOX P F.Encyclopedia of dairy sciences[M].Volumes 1-4.Academic press,2003.

[10]BOTSOGLOU N A,FLETOURIS D J.Drug residues in foods：pharmacology,food safety,and analysis[M].Marcel Dekker New York,2001.

[11]BRADLEY A,GREEN M.Factors affecting cure when treating bovine clinical mastitis with cephalosporin-based intramammary preparations[J].Journal of dairy science,2009.92（5）：1941-1953.

[12]GUILLEMOT D,CARBON C,BALKAU B,et al.Low dosage and long treatment duration ofβ-lactam：risk factors for carriage of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae[J].Jama,1998.279（5）：365-370.

[13]WILKE M S,LOVERING A L,STRYNADKA N C.Strynadka.β-Lactam antibiotic resistance：a current structural perspective[J].Current opinion in microbiology,2005.8（5）：525-533.

[14]崔生輝,李景云,馬越,等.“生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測(cè)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志,2007.19（2）：113-116.

[15]GUAY R,CARDINAL P,BOURASSA C,et al.Decrease of penicillin G residue incidence in milk：a fact or an artefact[J].International Journal of Food Microbiology,1987.4（3）：187-196.

[16]郭宗儒.藥物化學(xué)[M].北京：高等教育出版社,2005：441-445.

[17]彭司勛.藥物化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,1986：312-314.

[18]CUI S,LI J,HU C,et al.Development of a Method for the Detection of-Lactamases in Milk Samples[J].Journal of AOAC International,2007.90（4）：1128-1132.

[19]李斯亮.淺析“β-內(nèi)酰胺酶”的危害及解決方式[J].中國(guó)乳業(yè),2013（12）：63-64.

[20]周愛春.ESBLs顯色培養(yǎng)基的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)2009.6（5）：49-50.

[21]王寅,趙虎,孟麗,等.醫(yī)院感染病原菌AmpC與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2009（11）：1425-1427.

[22]李蓉,趙林,徐小文,等.紙片擴(kuò)散確認(rèn)法與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的比較[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）,2009.2：024.

[23]葉紅,潘玲麗.頭孢類抗菌素在輸液中的作用[J].中國(guó)藥師,2006.9（11）：1069-1071.

[24]薛曉晶,李玲,金涌,等.杯碟法檢測(cè)乳中的β-內(nèi)酰胺酶[J].食品科學(xué),2011.32（4）：216-219.

[25]魏國(guó)美.杯碟法測(cè)定乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶[J].福建分析測(cè)試,2010.19（3）：57-59.

[26]李錦榮,胡科鋒,張遠(yuǎn)平.抗生素分解劑β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法研究[J].現(xiàn)代食品科技,2011.27（8）：1020-1024.

[27]張明,鄭鳳娥,楊春暉.液體乳和乳飲料中β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法的研究[J].食品研究與開發(fā),2013.33（11）：44-48.

[28]李欣南,韓鐫竹,蘇崴藝.生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶微生物法檢測(cè)[J].中國(guó)乳品工業(yè),2015.43（3）：57-59.

[29]中華人民共和國(guó)藥典（2005年版）（二部）[M].北京；化學(xué)工業(yè)出版社.2005.

[30]SYKES R,NORDSTR M K.Microiodometric determination ofβ-lactamase activity[J].Antimicrobial agents and chemotherapy,1972.1（2）：94-99.

[31]NOVICK R.Micro-iodometric assay for penicillinase[J].Biochemical Journal,1962.83（2）：236.

[32]ANONYMOUS,β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試劑盒的優(yōu)勢(shì).［EB/OL］.http：//www.uni-bio.net/oyaya/onews.asp id=58.

[33]謝巖黎,張?chǎng)螢t,嚴(yán)瑞東,等.碘量法對(duì)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)[J].中國(guó)乳品工業(yè),2010（12）：36-37.

[34]HENRY R J,HOUSEWRIGHT R D.Studies on penicillinase II.Manometric method of assaying penicillinase and penicillin,kinetics of the penicillin-penicillinase reaction,and the effects of inhibitors on penicillinase[J].Journal of Biological Chemistry,1947.167（2）：559-571.

[35]張春輝,張曉根,胡功政.豬雞常見致病菌β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2005.25（2）：81-83.

[36]朱融融,牛奶中青霉素酶檢測(cè)方法初探 [EB/OL].http：//www.cjlfx.net.cn/cxds_27/zhongxue/301.htm.

[37]馬潔,李孝君,薛穎.利用酸度計(jì)檢測(cè)奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶 [J].化學(xué)通報(bào),2009（4）：370-373.

[38]O'CALLAGHAN C H,MORRIS A,KIRBY S M,et al.Novel method for detection ofβ-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1972.1（4）：283-288.

[39]O'CALLAGHAN C H,MUGGLETON P,ROSS G.Ross.Effects of beta-lactamase from gram-negative organisms on cephalosporins and penicillins[J].Antimicrobial agents and chemotherapy,1967.8：57-63.

[40]SCHINDLER P,HUBER G.Use of PADAC,a novel chromogenicβ-lactamase substrate,for the detection ofβ-lactamase producing organisms and assay ofβ-lactamase inhibitors/inactivators[M].Enzyme inhibitors.Verlag Chemie Weinheim（FRG）.1980：169-276.

[41]JORGENSEN J H,CRAWFORD S A,ALEXANDER G A.Pyridinium-2-azo-p-dimethylaniline chromophore,a new chromogenic cephalosporin for rapid beta-lactamase testing[J].Antimicrobial agents and chemotherapy,1982.22（1）：162-164.

[42]陳號(hào),馬文靜,田晉紅,等.牛奶中非法添加β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法及研究現(xiàn)狀[J].畜牧與飼料科學(xué),2010（1）：67-69.

[43]林楠,乳及乳制品中殘留青霉素鉀酶解產(chǎn)物檢測(cè)方法的研究[D].2008,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué).

[44]韓奕奕,王建軍,鄭雋,等.牛乳中三聚氰胺和β-內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)方法的評(píng)估——雙流向酶聯(lián)免疫法[J].中國(guó)奶牛,2009（6）：46-48.

[45]孫漢文，李輝，張敬軒，等.快速高分離液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)原乳中活性β-內(nèi)酰胺酶[J].分析化學(xué)2010.08：1203-1205.

[46]XU Z,WANG H-Y,HUANG S-X,et al.Determination ofβ-lactamase residues in milk using matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform mass spectrometry[J].Analytical chemistry,2010.82（5）：2113-2118.

[47]ZHOU S,WANG D,ZHAO Y,et al.A rapid HPLC method for indirect quantification ofβ-lactamase activity in milk[J].Journal of dairy science,2015.98（4）：2197-2204.

[48]LIU R,LIEW R,ZHOU J,et al.A Simple and Specific Assay for Real-Time Colorimetric Visualization ofβ-Lactamase Activity by Using Gold Nanoparticles[J].Angewandte Chemie,2007.119（46）：8955-8959.

[49]RUBTSOVA M Y,ULYASHOVA M M,EDELSTEIN M V,et al.Oligonucleotide microarrays with horseradish peroxidase-based detection for the identification of extended-spectrumβ-lactamases[J].Biosensors and Bioelectronics,2010.26（4）：1252-1260.

[50]ZHOU S,ZHAO Y,MECKLENBURG M,et al.A novel thermometric biosensor for fast surveillance ofβ-lactamase activity in milk[J].Biosensors and Bioelectronics,2013.49：99-104.

[51]LI L,LI Z,SHI W,et al.Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels ofβ-Lactamase in Staphylococcus aureus[J].Analytical chemistry,2014.86（12）：6115-6120.

[52]LIANG P,SANCHEZ R I,MARTIN M T.Electrochemiluminescence-based detection ofβ-lactam antibiotics andβ-lactamases[J].Analytical chemistry,1996.68（14）：2426-2431.

[53]HUJER A M,PAGE M G,HELFAND M S,et al.Development of a sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay for detecting and quantifying CMY-2 and SHVβ-lactamases[J].Journal of clinical microbiology,2002.40（6）：1947-1957.

[54]班付國(guó),劉宏偉,高延玲,等,生鮮奶及奶制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法,in http：//www2.drugfuture.com/cnpat/search.aspx.2009,徐皂蘭：中國(guó).

[55]WANG W,LIU L,XU L,et al.Detection ofβ-lactamase residues in milk by sandwich ELISA[J].International journal of environmental research and public health,2013.10（7）：2688-2698.