楊亞威，趙愛梅，王輯，楊貞耐

（北京工商大學 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京100048）

0 引言

乳酸菌（LAB）是一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細菌的總稱。一些乳酸菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生有利于人體健康的生理活性物質(zhì)胞外多糖[1-7]乳酸菌胞外多糖作為生物大分子，能夠改善發(fā)酵乳的流變學特性，增強產(chǎn)品的穩(wěn)定性和持水能力，并賦予產(chǎn)品良好的口感和風味[2]。

傳統(tǒng)內(nèi)蒙古奶豆腐是采用新鮮牛奶或羊奶經(jīng)乳酸菌的天然發(fā)酵而制成的具有獨特風味的一類乳制品。自然發(fā)酵奶豆腐中蘊藏著許多具有優(yōu)良特性的乳酸菌，為乳酸菌的研究開發(fā)提供了寶貴的資源。

本研究從內(nèi)蒙古不同地區(qū)采集奶豆腐樣品，對其中的乳酸菌進行分離鑒定，篩選具有優(yōu)良功能特性的菌株，重點對產(chǎn)胞外多糖菌株的潛在益生菌特性進行研究，以期獲得具有潛在應用價值的功能性乳酸菌菌株。

1 實驗

1.1 材料與試劑

內(nèi)蒙古不同地區(qū)牧民自制的奶豆腐樣品；鼠李糖乳桿菌GG，由作者所在實驗室保藏；牛膽鹽、膽固醇、胃蛋白酶，氫氧化鉀，國藥集團；正己烷、冰醋酸、濃硫酸，蛋白酶K，PCR反應所需相關試劑，乳酸菌16S rDNA通用引物。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌器（MLS-3750），立式高速冷凍離心機（CR21GⅢ），紫外可見分光光度計（U-3900），數(shù)顯pH 計，正置熒光顯微鏡（BX53F），PCR儀（T100TM Thermal Cycler）。

1.3 培養(yǎng)基

SDM液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母氮源6.7 g，磷酸氫二鉀2 g，無水乙酸鈉5 g，檸檬酸鈉5 g，七水硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，葡萄糖20 g，吐溫-80（聚氧乙烯油酸基脫水山梨酸）1 mL，加水至1 000 mL，濃度為1 mol/L乙酸調(diào)pH=6.6。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，無水乙酸鈉5 g，檸檬酸鈉5 g，磷酸氫二鈉2 g，吐溫80 1 mL，七水硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.05 g，加水至1 000 mL，濃度為1 mol/L乙酸調(diào)pH=6.6。

耐酸試驗培養(yǎng)基：用濃度為1 mol/L的鹽酸將MRS液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至2.5，115℃滅菌15 min。

耐膽鹽試驗培養(yǎng)基：配制膽鹽質(zhì)量分數(shù)為1.0%的MRS液體培養(yǎng)基，115℃滅菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

稱取1 g內(nèi)蒙古奶豆腐樣品，加入99 mL無菌PBS緩沖液（pH=6.5）中，充分振蕩混勻后，稀釋到10-4和10-5，取100 μL稀釋液涂布于MRS瓊脂平板上，置于37℃厭氧培養(yǎng)24～72 h，挑取典型單菌落，劃線分離純化。

提取菌株的基因組DNA進行片段擴增：采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物，正向引物：A27F 5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGC TACCTTGTTACGA-3'，反向引物：A1495R 3'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTATCCTGGCTCAG-5'，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目標片段長度約1 500 bp。PCR產(chǎn)物委托北京鼎國生物有限公司進行測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行比對。

將所測菌株的16S rDNA序列用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性比較，選取同源性較高的相關菌株的16S rDNA區(qū)域序列作為參比對象，采用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.2 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

（1）胞外多糖標準曲線的繪制。葡萄糖標準曲線的繪制參照Dubois等[3]的方法

（2）胞外多糖產(chǎn)量的測定。將活化好的菌株按2%接種于滅菌的SDM培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18 h，然后于100℃水浴加熱15 min以滅活可能存在的降解多糖的酶類[4]。

胞外多糖的提取參照RIMADA[5]等的方法，往滅酶冷卻的發(fā)酵液中加入質(zhì)量濃度為800 g/L的三氯乙酸溶液至終質(zhì)量濃度為40 g/L，室溫下攪拌2 h。在10 000 r/min下離心45 min去除細胞和蛋白。取上清液并加入兩倍體積的無水乙醇，4℃冷藏靜置12 h后10 000 r/min離心30 min，沉淀用蒸餾水溶解，再加兩倍體積無水乙醇，4℃靜置12 h后于10 000 r/min離心30 min，沉淀用蒸餾水溶解，裝入分子截流量為8 000～14 000的透析袋中透析24 h，每8 h換一次水。

1.4.3 菌株在模擬人工胃液中的耐受性測定

活化好的菌株按體積分數(shù)2%接種于pH值調(diào)至2.5的MRS液體培養(yǎng)基中；以MRS培養(yǎng)基（pH=6.6）為空白。在培養(yǎng)的第0，1，3 h時取出，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，并于MRS平板上涂布，每個稀釋梯度做3個平行樣，37℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

存活率=Nt/N0×100%，

式中：N0和Nt分別為經(jīng)pH值為2.5的MRS液體培養(yǎng)基處理0和t小時后的活菌數(shù)（N0和Nt均為對數(shù)值）。

1.4.4 菌株對高濃度膽鹽的耐受性測定

將活化好的菌液按體積分數(shù)2%接種于膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.5%的MRS培養(yǎng)基中，以未添加膽鹽的MRS培養(yǎng)基為空白。在培養(yǎng)的第0，2，4 h時取出，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，并于MRS平板上涂布，每個稀釋梯度做3個平行樣，37℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

存活率=Nt/N0×100%，

式中：Nt為含牛膽鹽MRS培養(yǎng)基處理t小時后活菌數(shù)；N0為含牛膽鹽MRS培養(yǎng)基處理0小時后活菌數(shù)（N0和Nt均為對數(shù)值）。

1.4.5 菌株疏水性測定

參照WANG等的方法[6]，將待測菌液于4℃、10 000 g下離心5 min，收集菌體，用滅菌的PBS緩沖液（pH=7.2）洗滌兩次，以緩沖液作為調(diào)零液，用PBS調(diào)整菌體濃度使其在560 nm下吸光度為1.00。然后取3 mL吸光度為1.00的菌液，分別加入0.6 mL的十六烷和甲苯，漩渦震蕩使其充分混合，待其靜置分層后取下層水相測定其在560 nm下測吸光度。疏水率計算公式為疏水率=（A0-A）/A×100%，

式中：A0為菌液與吸附劑混勻前的吸光度；A為菌液與吸附劑混勻后的吸光度。

1.4.6 菌株的體外降膽固醇能力測定

將待測菌株依次傳代活化3代后使其恢復活力，按體積分數(shù)為3%接種于含有質(zhì)量濃度約100 μg/mL膽固醇的MRS-THIO培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，采用鄰苯二甲醛比色法[7]測定培養(yǎng)基中殘留膽固醇質(zhì)量濃度。

將培養(yǎng)后的菌液離心（6 000 g，4 ℃，10 min），取上清液0.5 mL于18 mm×18 cm試管中，依次加入3 mL體積分數(shù)為95%的乙醇和2 mL質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的氫氧化鉀溶液，漩渦震蕩混勻后置于60℃水浴中皂化10 min，迅速冷卻后加入5 mL正己烷，漩渦震蕩1 min進行萃取，靜置10 min后加入3 mL水，重復震蕩1 min后在室溫下靜置10 min，待分層后取2.5 mL正己烷層于15 mm×15 cm試管中，置于60℃水浴中用氮氣吹干溶劑，加入4 mL鄰苯二甲醛顯色劑，漩渦震蕩1 min后靜置10 min，加入2 mL濃硫酸震蕩1 min，室溫下靜置10 min后于550 nm處測吸光度，以不加菌株的含膽固醇培養(yǎng)基為空白對照，計算其膽固醇移除率（實驗重復3次），即膽固醇移除率=（A0-A1）/A0×100%，式中：A0為未接菌的MRS-THIO液體培養(yǎng)基在550 mm處的吸光度；A1為發(fā)酵上清液在550 mm處的吸光度。

1.4.7 菌株的抑菌活性測定

采用改進的Hechard等[8]的瓊脂平板擴散法。選取4株常見的致病菌：金黃色葡萄球菌CMCC26071、大腸桿菌CMCC44825、福氏志賀氏菌CMCC51061和鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115，分別接種到適宜的瓊脂培養(yǎng)基上，無菌條件下放置5 h。待瓊脂板凝固后用直徑為8 mm的牛津杯在瓊脂培養(yǎng)基上打孔。將活化好的菌液，經(jīng)1 000 g、4℃離心10 min，收集上清液備用。為了排除過氧化氫以及乳酸的干擾，上清液應經(jīng)微孔濾膜過濾后再調(diào)pH6.0，同時添加無菌的過氧化氫酶（1 000 U/L）。取處理過的上清液50 μL加入到瓊脂板上的孔中，然后放到適宜條件下培養(yǎng)48 h。用直尺測量抑菌圈的直徑。抑菌效果按以下標準評定：當無抑菌圈時，代表無抑制作用（-）；當抑菌圈直徑在0～3 mm之間，代表抑菌效果弱（+）；當抑菌圈直徑在3～6 mm之間，代表抑菌效果良好（++）；當抑菌圈直徑大于6 mm，代表抑菌效果強（+++）[9]。

1.4.8 菌株的抗生素藥敏性測定

采用改進的Charteris等[10]的方法。選用8種抗生素：青霉素、氯霉素、硫酸鏈霉素、硫酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素、頭孢噻肟和利福平。將活化好的菌株按體積分數(shù)3%接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期（106～107mL-1）。取50 μL菌液到MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，無菌條件下室溫放置1 h。待平板凝固后將抗生素藥敏紙片放至平板上，37℃培養(yǎng)24 h?？股氐乃幟粜詤⒄誛HO提供的NCCLS最新版本的標準進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 奶豆腐中乳酸菌的分離鑒定

從15個內(nèi)蒙古奶豆腐樣品中共分離得到51株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株。對各菌株經(jīng)過DNA提取，16S rDNA PCR擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得片段長度在1 500 bp左右的特異性條帶。將獲得的特異性片段純化后進行測序，測序結(jié)果用Blast進行序列同源性比對，采用16S rDNA序列分析的方法鑒定，鑒定結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，從奶豆腐中分離得到的51株乳酸菌包括植物乳桿菌13株（占25.49%），發(fā)酵乳桿菌9株，鼠李糖乳桿菌8株，乳酸片球菌7株，戊糖片球菌6株，融合魏斯氏菌4株，糞腸球菌2株，瑞士乳桿菌1株和副干酪乳桿菌1株。采用MEGA5.0軟件，選取本研究部分代表性菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，這些菌株與對應NCBI上公布的菌株之間具有良好的親緣關系，進一步佐證了上述鑒定結(jié)果。由此可見，奶豆腐中乳酸菌種類豐富，數(shù)量繁多，其中以乳桿菌為優(yōu)勢菌株。周雨霞[11]對內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌進行了分離鑒定，認為植物乳桿菌是該地區(qū)乳制品中的優(yōu)勢菌，與本文研究結(jié)果一致。

2.2 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

表1 奶豆腐中乳酸菌菌株鑒定結(jié)果

用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線，公式為

Y=0.0087X＋0.0232，R2=0.9994，

式中：Y為波長為490 nm處的吸光度A，X為溶液中胞外多糖質(zhì)量濃度。多糖產(chǎn)量質(zhì)量濃度在0到220 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。本研究選取了SDM[12]培養(yǎng)基來檢測乳酸菌代謝產(chǎn)生胞外多糖的情況。其中SDM培養(yǎng)基為改良的MRS培養(yǎng)基，去除了牛肉膏、蛋白胨等復雜成分的干擾。胞外多糖含量為樣品含糖量減去空白培養(yǎng)基的背景干擾值[13]。

圖1 基于16SrRNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

對奶豆腐樣品中分離得到的51株乳酸菌在SDM培養(yǎng)基中的產(chǎn)胞外多糖情況進行了測定，結(jié)果表明，植物乳酸桿菌1-2、3-1、12-4和副干酪乳桿菌6-1在SDM培養(yǎng)基中的胞外多糖產(chǎn)量分別為31.27，15.04，22.02和24.10 mg/L，明顯高于對照益生性鼠李糖乳桿菌菌株GG的胞外多糖產(chǎn)量（7.62 mg/L）。鑒定結(jié)果表明編號為1-2、3-1和12-4的菌株為植物乳桿菌（GenBank登錄號分別為AB795645.1，EU419598.1和KM495856.2），編號為6-1的菌株為副干酪乳桿菌（GenBank登錄號KF149312.1）。本研究以下實驗對上述4株乳酸菌進行了潛在益生菌特性的分析測定，以鼠李糖乳桿菌GG作為對照菌株。

2.3 菌株在模擬人工胃液中的耐受性

益生菌通常是以食物攜帶或以制劑形式口服進入人體消化系統(tǒng)。然而，人體消化道系統(tǒng)不斷分泌胃液的酸性環(huán)境構(gòu)成了阻止大多數(shù)微生物進入腸道的天然屏障。人體空腹時胃液pH值一般在1.3～1.8之間，進食后上升到3.0左右或更高，食物在胃中需停留約3 h。因此，經(jīng)口腔攝入的益生菌必須耐受胃液的酸性環(huán)境、腸道的膽鹽環(huán)境和厭氧環(huán)境，并定植于腸道中，才能有效地在人體內(nèi)發(fā)揮其益生作用[14]。圖2為植物乳桿菌1-2、3-1和12-4和副干酪乳桿菌6-1對模擬人工胃液（pH=2.5）表現(xiàn)出不同程度的耐受性。在培養(yǎng)時間為1 h時，對照菌株鼠李糖乳桿菌GG的存活率為93.45%，而植物乳桿菌菌株1-2、3-1和12-4的存活率也均大于90%，副干酪乳桿菌6-1的存活率約80%。在模擬人工胃液中培養(yǎng)3 h后，各菌株的存活率明顯下降，鼠李糖乳桿菌GG存活率為51.62%，植物乳桿菌1-2和3-1的存活率達到65%以上，而植物乳桿菌12-4和副干酪乳桿菌6-1的存活率較低，約為47%。

圖2 乳酸菌菌株在模擬人工胃液中的耐受性

2.4 菌株對高濃度膽鹽的耐受性

正常人體小腸中膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.03%～0.3%，經(jīng)口腔攝入的活性乳酸菌必須有一定的膽鹽耐受能力才能定植于小腸發(fā)揮其有益于人體健康的作用[15]。據(jù)報道，小腸是人體吸收膽固醇的重要場所，同時也是乳酸菌發(fā)揮其降膽固醇作用的主要部位[16]。由圖3可以看出，各菌株在膽鹽（0.5%）中的生長受到了不同程度的抑制。植物乳桿菌1-2、3-1和副干酪乳桿菌6-1對膽鹽的耐受性較強，培養(yǎng)4h后菌株的存活率達到90%以上，高于植物乳桿菌12-4（低于70%）和對照菌鼠李糖乳桿菌GG（低于80%）。據(jù)Cotter等[17]報道，乳酸菌必須以活性狀態(tài)能夠耐受胃液的酸性環(huán)境和膽鹽的抑制作用，才能順利到達腸道，因此同時具備較好的耐酸和耐膽鹽特性是益生菌的前提條件。本研究中，植物乳桿菌1-2和3-1的耐酸和耐膽鹽特性相對較強。

圖3 不同膽鹽質(zhì)量分數(shù)下乳酸菌菌株的生長情況

2.5 菌株的疏水性

益生菌必須能夠有效地粘附于腸道粘膜并形成穩(wěn)定的生物屏障，才能抑制病原菌的入侵和增殖[18]。乳酸菌的疏水作用是乳酸菌與宿主之間相互作用的因素之一，與多種生物黏附現(xiàn)象有關，如組織表面的粘附、細菌間的集聚等[19]。本研究對各菌株的疏水性測定結(jié)果如圖4所示。對照菌鼠李糖乳桿菌GG對甲苯和十六烷的疏水率分別為19.47和15.68%，高于實驗菌株。而植物乳桿菌1-2的疏水性優(yōu)于其他3株受試菌，其對甲苯和十六烷的疏水率分別為15.07%和14.03%。趙維俊[20]等研究發(fā)現(xiàn)，菌株的黏附特性與疏水性成正相關，疏水性高的菌株更有利于定植于腸道內(nèi)。本實驗篩選出的植物乳桿菌1-2具有較好的疏水性，有利于其黏附定植于腸道。

2.6 菌株的體外降膽固醇能力

血清膽固醇水平偏高易引起心腦血管疾病，雖然使用藥物可有效地降低膽固醇含量，但是同時具有一定的副作用，如橫紋肌溶解、肝功能損害以及使人嗜睡、惡心嘔吐等[21]。有研究表明，服用乳酸菌及其相關制品可以有效地減少人體血清中膽固醇的含量。WANG等[22]和ZHANG等[23]分別從西藏靈菇中分離出植物乳桿菌菌株MA2和菌株K25，通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，2株植物乳桿菌均具有一定的降低小鼠體內(nèi)膽固醇的能力。

圖4 乳酸菌菌株的疏水性比較

由圖5中可以看出，本研究的4株乳酸菌均具有不同程度的體外降低膽固醇的能力。植物乳桿菌1-2的膽固醇降解率為44.33%。高于其他3株菌（降解率30%以上），但低于對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG（降解率56%）。

圖5 乳酸菌菌株對培養(yǎng)基中膽固醇的移除率

2.7 菌株的抑菌活性

乳酸菌在代謝過程中能產(chǎn)生各種具有抑菌活性的成分，如有機酸、過氧化氫和細菌素等，這些代謝產(chǎn)物通過抑制胃腸道中的有害菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等，可以改善胃腸道的微生態(tài)環(huán)境[24，25]。

由表2可知，本研究的4株乳酸菌對病原菌具有不同的抑制效果。4株受試菌株及對照菌株鼠李糖乳桿菌GG都對沙門氏菌和志賀氏菌具有較好的抑制作用，植物乳桿菌3-1和12-4還對大腸桿菌具有明顯的抑制作用。韓省等[26]從自釀酸奶中篩選出一株具有高抑菌活性的乳桿菌，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。

表2 乳酸菌菌株的抑菌作用

表3 乳酸菌菌株的抗生素藥敏性

2.8 菌株的抗生素敏感性

抗生素藥敏性一般分為耐藥（R）、中度敏感（M）和敏感（S）3個等級。據(jù)Miller[27]和Simpson[28]等報道，Lactobacilli、Pediococci和 Leuconostoc spp.對萬古霉素具有天然的抗性。Essid等利用瓊脂片擴散法對分離自腌肉中的17株植物乳桿菌進行了藥敏性分析，結(jié)果表明，所有菌株均對諾氟沙星、慶大霉素、卡那霉素、頭孢呋辛和硫酸鏈霉素敏感，但對四環(huán)素具有耐藥性。由表3可知，本研究的4株乳酸菌對不同抗生素具有不同程度的耐藥性。4株乳酸菌對鏈霉素和萬古霉素都表現(xiàn)為耐藥，對卡那霉素、慶大霉素和青霉素的耐受性較好。而對于氯霉素、利福平和頭孢噻肟較為敏感。植物乳桿菌1-2和副干酪乳桿菌6-1可以耐受5種抗生素，而植物乳桿菌12-4可以耐受3種抗生素。

3 結(jié)論

本研究從內(nèi)蒙古奶豆腐中分離出51株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA鑒定和菌株產(chǎn)胞外多糖情況分析，其中乳桿菌32株，有4株乳桿菌產(chǎn)胞外多糖，即植物乳桿菌菌株1-2、3-1和12-4以及副干酪乳桿菌6-1。對這些產(chǎn)胞外多糖菌株進行了模擬人工胃液耐受性、膽鹽耐受性、疏水性、體外降膽固醇、抗生素耐受性和過氧化氫耐受性的測定分析，植物乳桿菌菌株1-2和12-4具有良好的潛在益生菌特性，可應用于功能性產(chǎn)品的研究開發(fā)。

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