一種新型訓(xùn)練蜜蜂裝置的初步探索

狄納言，高 潔

(1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，昆明 650223;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

雖然蜜蜂Apis 的腦部結(jié)構(gòu)簡單，但是卻具有比較強的學(xué)習(xí)及記憶能力。例如，意大利蜜蜂Apis mellifera 通過學(xué)習(xí)記憶能夠識別花粉與花蜜的味道或者顏色，形成永久記憶(Kandel，2001)。蜜蜂的嗅覺記憶是研究嗅覺的經(jīng)典模型，嗅覺在蜜蜂學(xué)習(xí)、覓食過程中起重要作用(Breed，1983)，意大利蜜蜂擁有163個嗅覺受體基因(Robertson and Wanner，2006;Weinstock et al.，2006)，具有很強的嗅覺記憶能力(Laska et al.，1999)。蜜蜂的正?；顒影霃綖?-3 km，通過學(xué)習(xí)和記憶飛行途徑的地形、地貌，能從巢外復(fù)雜的環(huán)境中回到蜂巢(Pahl et al.，2011)。蜜蜂作為研究學(xué)習(xí)記憶行為的重要模式昆蟲，針對蜜蜂的學(xué)習(xí)與記憶機制已經(jīng)被各國各科研工作者用于研究(Menzel，2001)，已被作為研究動物學(xué)習(xí)與記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)的標準模型(Hammer and Menzel，1998;鄭火青和胡福良2009;Gronenberg and Couvillon，2010)。

在研究蜜蜂的學(xué)習(xí)和記憶過程中，通常需要訓(xùn)練蜜蜂。早在1986年Getz 等人依據(jù)巴甫洛夫條件反射原理，在Bitterman 等人的基礎(chǔ)上(1983)，建立條件刺激(CS)結(jié)合非條件刺激(US)的蜜蜂模式(Getz et al.，1986)，訓(xùn)練方法為:用氣體A(CS+，即conditioned stimulus)對著蜜蜂觸角吹3 s，若蜜蜂伸吻則給予一滴糖漿(US+，即unconditioned stimulus)。蜜蜂均受訓(xùn)一次后，用另一種氣體B(CS-)對著蜜蜂觸角吹3 s，若蜜蜂對氣體B 無反應(yīng)則給予一滴氯化鈉(US-)溶液。如果氣體A 與氣體B 對比足夠大，則可以實現(xiàn)訓(xùn)練工蜂對氣體A 有反應(yīng)而對氣體B 無反應(yīng)。其中，條件刺激(CS)和非條件刺激(US)控制是關(guān)鍵，關(guān)系訓(xùn)練效果。

本文提出利用軟件控制條件刺激和非條件刺激的時間、強度(流量)等參數(shù)，研制了一輪可訓(xùn)練10 頭蜜蜂的自動訓(xùn)練儀，實現(xiàn)了對訓(xùn)練過程的精確控制，為蜜蜂學(xué)習(xí)記憶行為提供一種更為便捷、高效、精確的方法。

1 材料與方法

蜜蜂訓(xùn)練裝置的主要由刺激系統(tǒng)和蜜蜂旋轉(zhuǎn)訓(xùn)練臺、控制器、紅外檢測器以及計算機軟件組成。基于計算機控制給予條件刺激(氣味)的氣壓系統(tǒng)、非條件刺激(糖漿)的機械系統(tǒng)和變換受訓(xùn)蜜蜂位置的旋轉(zhuǎn)臺。氣壓系統(tǒng)包括:氣瓶、氣泵、氣管和流量計;機械系統(tǒng)包括:電機、注射器、飼喂盤和液管。整個裝置的實物圖和示意圖如下:

刺激系統(tǒng)，即條件刺激部分與非條件刺激部分結(jié)構(gòu)如圖3 所示，條件刺激利用氣壓系統(tǒng)傳輸:氣泵與流量計相連，流量計控制氣流大小;控制器與旋轉(zhuǎn)訓(xùn)練臺上的出氣孔相連，通過電磁閥的開閉控制出氣時間以及出氣孔(A 孔或B 孔)，同時訓(xùn)練氣與風(fēng)扇相連，通過控制器控制風(fēng)扇抽氣，確保訓(xùn)練前、后旋轉(zhuǎn)訓(xùn)練臺上沒有殘留氣味，影響下一只蜜蜂受訓(xùn)。由計算機軟件控制氣體的開關(guān)信號，并通過USB7408N 連接控制器軟件上可設(shè)定氣體通道、氣體時間、以及抽氣時間等訓(xùn)練參數(shù)。非條件刺激利用液壓傳輸系統(tǒng)，由計算機軟件提供糖漿喂食信號，通過USB7408N 連接控制器控制喂食電機運動并同步聯(lián)動糖漿電機，將無菌注射器中的蔗糖糖漿通過糖漿管運輸?shù)叫D(zhuǎn)訓(xùn)練臺上的糖漿滴管，通過控制臺控制糖漿時間以及糖漿流速，糖漿從滴管滴落在糖漿盤上，供蜜蜂取食，以此達到自動喂食蜜蜂的效果。

圖1 蜜蜂訓(xùn)練裝置實物圖Fig.1 The stimulation apparatus for bee trained

圖2 蜜蜂訓(xùn)練裝置示意圖Fig.2 The diagram of stimulation apparatus for bee trained

圖3 蜜蜂訓(xùn)練裝置條件刺激與非條件刺激部分電路圖Fig.3 The circuit diagram that indicates the conditioned stimulus and the unconditioned stimulus

2 結(jié)果與分析

2.1 訓(xùn)練蜜蜂準備

選擇一群蜜蜂，在蜂巢門口，于8∶00-10∶00攔截出巢工蜂15-20 頭，將其放入小玻璃瓶內(nèi)(每個小玻璃瓶內(nèi)放入1-2 頭)，4℃冰水混合物中麻痹至蜜蜂無活動后，取出將其固定在專用的金屬支架上，只留有頭部和觸角可自由活動。待蜜蜂蘇醒后，用糖漿輕觸蜜蜂的觸角，誘導(dǎo)蜜蜂伸吻后讓蜜蜂吸食糖漿，直至吃飽。把喂飽的蜜蜂放入暗室2 h(溫度25℃、濕度85%)后取出蜜蜂，糖漿輕觸蜜蜂的觸角檢測是否伸吻，如果伸吻，表明該蜜蜂具有良好的反應(yīng)能力，可用于訓(xùn)練。每次選擇10 頭放到旋轉(zhuǎn)訓(xùn)練臺上用于訓(xùn)練。

2.2 蜜蜂訓(xùn)練方法

采用目標氣體和空白(空氣)訓(xùn)練重復(fù)的方法訓(xùn)練蜜蜂。所用供試蜜蜂隨機分為2 組，一組接受手動訓(xùn)練，另一組接受儀器自動訓(xùn)練，訓(xùn)練操作方法如下:

2.2.1 自動訓(xùn)練方法

目標氣體訓(xùn)練:在黑暗通風(fēng)廚內(nèi)，首先打開自動訓(xùn)練裝置上的紅光燈罩，然后打開Bee Training 程序，選擇氣體通道并設(shè)定訓(xùn)練前等待時間、給氣時間、給糖時間，以及抽氣時間等參數(shù)后，儀器將自動將1 頭蜜蜂旋轉(zhuǎn)到訓(xùn)練位置(即同時施于條件刺激和非條件刺激位置)，后停留40 s 讓其熟悉訓(xùn)練臺，接收條件刺激(CS)5 s(氣體流速33 mL/s)，在條件刺激的第3 秒，給予非條件刺激3 s(溢出糖漿20μL)，讓蜜蜂吸吮糖漿，然后讓蜜蜂在訓(xùn)練位置再停留15 s，下待訓(xùn)1 頭蜜蜂自動旋轉(zhuǎn)到訓(xùn)練位置，重復(fù)以上訓(xùn)練。單只蜜蜂的訓(xùn)練時間為1 min，10 頭蜜蜂完成訓(xùn)練的時間為10 min。

空白氣體訓(xùn)練方法:當(dāng)所有蜜蜂都經(jīng)過一次訓(xùn)練后，所有訓(xùn)練參數(shù)不變，但條件刺激的氣體為空氣，讓所有蜜蜂都接受一次僅有空氣流的空白訓(xùn)練，這個過程是為了消除氣流對蜜蜂的機械刺激。

每次讓10 頭蜜蜂接受3 次目標氣味和3 次空白氣流的刺激訓(xùn)練。訓(xùn)練好的蜜蜂喂飽后放入暗室，待用。

2.2.2 手動訓(xùn)練方法

手動訓(xùn)練參數(shù)同上，由訓(xùn)練人員手動給予蜜蜂條件和非條件刺激。

2.3 訓(xùn)練效果檢測

2 h 后從暗室拿出蜜蜂，用糖漿檢測是否伸吻，淘汰沒有伸吻的蜜蜂。將10 頭蜜蜂放入旋轉(zhuǎn)控制臺，軟件設(shè)定僅給氣，不給糖漿。用目標氣味刺激這些蜜蜂，觀察其是否伸吻，再用空氣刺激確定其是否伸吻，如果對目標氣味刺激伸吻且對空白氣流刺激不伸吻，表明這些蜜蜂已學(xué)會并記住了該氣味，記錄學(xué)會并記住氣味的蜜蜂數(shù)量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用上述2種方法，每次訓(xùn)練50 頭蜜蜂，重復(fù)訓(xùn)練6 次，共訓(xùn)練600 多頭蜜蜂。統(tǒng)計每次50 頭中學(xué)會和記住目標氣味的蜜蜂數(shù)量N，計算訓(xùn)練的成功率:P=N/50×100%。之后得到6 次訓(xùn)練成功率的平均值。

圖4 蜜蜂訓(xùn)練裝置與手動訓(xùn)練成功率比較Fig.4 The success rate of apparatus and manually operated for training bees

使用蜜蜂訓(xùn)練裝置自動訓(xùn)練蜜蜂數(shù)共301 頭;手動訓(xùn)練蜜蜂數(shù)共304 頭，蜜蜂訓(xùn)練裝置的平均成功率為58.47%，手動訓(xùn)練蜜蜂的平均成功率為49.67%。試驗結(jié)果使用SPSS19.0 進行χ2檢驗，結(jié)果表明:使用蜜蜂訓(xùn)練裝置，訓(xùn)練成功率顯著高于手動訓(xùn)練(χ2=9.822，P=0.002)，說明蜜蜂訓(xùn)練裝置對蜜蜂的訓(xùn)練效果優(yōu)于手動訓(xùn)練。

3 結(jié)論與討論

蜜蜂訓(xùn)練裝置作為一種新型的訓(xùn)練蜜蜂儀器，具有更為精準、快捷的優(yōu)勢。蜜蜂訓(xùn)練裝置的優(yōu)勢表現(xiàn)為:

首先，通過計算機軟件控制條件和非條件刺激，能控制施放刺激方式，單獨或同時，以及刺激蜜蜂的時間和強度，讓受訓(xùn)蜜蜂建立有效的條件反射。并且位于糖滴管下方紅外檢測器自動記錄蜜蜂展吻問數(shù)，如是否展吻和展吻次數(shù)，不僅實現(xiàn)了訓(xùn)練、檢測的自動化，并且訓(xùn)練結(jié)果自動保存，極大提高訓(xùn)練效率。

其次，蜜蜂訓(xùn)練裝置可對氣體通道自動選擇，通過軟件控制2個氣瓶閥門開關(guān)。使用空氣消除蜜蜂對氣流、位置的感知，控制給氣量可以降低試驗誤差，避免因給氣量的不同而導(dǎo)致蜜蜂記憶差異，讓蜜蜂更快建立“氣味—獎勵”這一條件反射。

再次，蜜蜂訓(xùn)練裝置縮短訓(xùn)練時間，蜜蜂訓(xùn)練裝置1 min 針對1 頭蜜蜂進行訓(xùn)練，一輪10 頭蜜蜂訓(xùn)練一次需10 min，提高訓(xùn)練效率。

此外，旋轉(zhuǎn)訓(xùn)練臺可加載LED 紅光燈罩，消除視覺對蜜蜂的影響，減少環(huán)境對訓(xùn)練結(jié)果的影響。在下一步工作中，將增加自動刺激觸角裝置，在器件的選擇、電路的設(shè)計上進行改進，特別要注意非條件刺激控制部分的改進，提高訓(xùn)練蜜蜂的精度和成功率。

References)

Bitterman ME，Menzel R，F(xiàn)ietz A，et al.Classical conditioning of proboscis extension in honeybees(Apis mellifera)［J］.Journal of Comparative Psychology，1983，97(2):107.

Breed MD.Nest mate recognition in honeybees［J］.Animal Behavior，1983，31(1):86-91.

Getz WM，Brückner D，Smith KB.Conditioning honeybees to discriminate between heritable odors from full and half sisters［J］.Journal of Comparative Physiology A，1986，159(2):251-256.

Gronenberg W，Couvillon MJ.Brain composition and olfactory learning in honey bees［J］.Neurobiology of Learning and Memory，2010，93(3):435-443.

Hammer M，Menzel R.Multiple sites of associative odor learning as revealed by local brain microinjections of octopamine in honeybees［J］.Learning ＆ Memory，1998，5(1):146-156.

Kandel ER.The molecular biology of memory storage:a dialogue between genes and synapses［J］.Science，2001，294(5544):1030-1038.

Laska M，Galizia CG，Giurfa M，et al.Olfactory discrimination ability and odor structure-activity relationships in honeybees［J］.Chemical Senses，1999，24(4):429-438.

Menzel R.Searching for the memory trace in a mini-brain，the honeybee［J］.Learning ＆ Memory，2001，8(2):53-62.

Pahl M，Zhu H，Tautz J，et al.Large scale homing in honeybees［J］.PLoS One，2011，6(5):e19669.

Robertson HM，Wanner KW.The chemoreceptor superfamily in the honey bee，Apis mellifera:expansion of the odorant，but not gustatory，receptor family［J］.Genome Research，2006，16(11):1395-1403.

Weinstock GM，Robinson GE，Gibbs RA，et al.Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera［J］.Nature，2006，443(7114):931-949.

Zheng HQ，Hu FL.Honeybee:a newly emerged model organism［J］.Acta Entomologica Sinica，2009，52(2):210-215.［鄭火青，胡福良.蜜蜂:新興的模式生物［J］.昆蟲學(xué)報，2009，52(2):210-215］