邱偉 程興群 周學(xué)東 李雨慶

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都 610041

c-di-AMP[1]是近些年繼cAMP、c-di-GMP后新發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)菌和支原體中廣泛存在的環(huán)核苷酸第二信使分子，這些細(xì)菌包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[1-3]、單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）[4-6]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[7]、肺炎鏈球菌（Streptococcus pyogenes）[8]、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）[9]、乳桿乳球菌（Lactococcus lactis）[10]。c-di-AMP能夠調(diào)控多種細(xì)菌生理活動，與多種致病微生物的毒力因子密切相關(guān)。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）是革蘭氏陰性、專性厭氧的產(chǎn)黑色素桿菌，是目前公認(rèn)的牙周炎主要病原菌之一[11-12]。本課題組通過前期的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在牙齦卟啉單胞菌的基因組中存在一個c-di-AMP合成酶的編碼基因（pgn0523）和兩個c-di-AMP分解酶的編碼基因（pgn1187，pgn2003）。本實驗擬通過對這3個牙齦卟啉單胞菌第二信使分子c-di-AMP合成和分解代謝相關(guān)基因進行克隆以及表達(dá)純化，得到較高濃度和純度的目的蛋白，為進一步推測牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP的體內(nèi)代謝途徑、探究c-di-AMP對牙齦卟啉單胞菌的生長及毒力的調(diào)控作用等奠定理論基礎(chǔ)，為牙周炎疾病的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-28a載體（Novagen公司，德國），T4 DNA連接酶（TaKaRa公司，日本），Taq DNA聚合酶（Toyobo公司，日本），限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和NotⅠ（TaKaRa公司，日本），Ni-Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare公司，美國），基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），實驗引物合成、DNA序列測定[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

牙齦卟啉單胞菌ATCC33277（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室），大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技（北京）有限公司]，LB培養(yǎng)基、改良BHI培養(yǎng)基（Sigma公司，美國）。

1.3 引物

根據(jù)GenBank所提供的牙齦卟啉單胞菌pgn0523、pgn1187和pgn2003基因序列設(shè)計并合成特異性引物（表1）。3個目的基因上下游引物均分別包含XbaⅠ和NotⅠ的限制性酶切位點。

1.4 目的基因的擴增

通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）克隆牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三個基因。將牙齦卟啉單胞菌接種于改良BHI培養(yǎng)基（添加1 mg·L-1維生素K1、5%氯化血紅素、5%脫纖維蛋白羊血）瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)（80%N2，10%CO2及10%H2）培養(yǎng)。3 d后常規(guī)接種、傳代、涂片及生化鑒定，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將平板上的牙齦卟啉單胞菌菌落收集入2 mL的EP管中，使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書操作步驟提取牙齦卟啉單胞菌的基因組DNA。以牙齦卟啉單胞菌基因組DNA為模版進行PCR擴增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，進入熱循環(huán)（98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min），共35個循環(huán)，最后68 ℃再延伸8 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的基因片段。

表1 pgn0523、pgn1187和pgn2003基因特異性引物Tab 1 Gene-specific primers for pgn0523, pgn1187 and pgn2003

1.5 含目的基因的原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將擴增得到的目的基因片段與大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET28a分別用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和Not Ⅰ雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分別回收酶切產(chǎn)物中的目的基因片段和原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a片段，并用T4 DNA連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有30 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板，挑選卡那霉素陽性克隆進行增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，并將其送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 目的蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將酶切驗證及測序鑒定正確的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基瓊脂平板，挑選卡那霉素陽性克隆分別接種到2 mL含卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1︰100稀釋，加入到4 mL含卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h增菌，當(dāng)吸光度OD600nm為0.6左右時，分別向培養(yǎng)液中加入終濃度為800 μg·mL-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG），37 ℃、150 r·min-1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。分別誘導(dǎo)2 h和6 h后，以5 000 r·min-1、4 ℃離心30 min收集菌體沉淀，并加入200 μlPBS重懸，吸取重懸液20 μL于EP管中，加入16 μL十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液和4 μL二硫蘇糖醇，混合后沸水煮10 min，10 000 r·min-1離心1 min。分別取10 μL制備好的蛋白樣品進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電泳結(jié)束后通過0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析鑒定。

1.7 鎳離子金屬親和層析法純化目的蛋白

將經(jīng)SDS-PAGE分析確定目的蛋白得到正確表達(dá)的大腸桿菌菌株接種到2 mL含卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1︰100稀釋，加入到100 mL含卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)2～3 h增菌，當(dāng)OD600為0.6左右時，分別向培養(yǎng)液加入終濃度為800 μg·mL-1的IPTG，37 ℃、150 r·min-1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。分別誘導(dǎo)2 h和6 h后，以5 000 r·min-1、4 ℃離心30 min收集菌體沉淀，每克沉淀加入5 mL 緩沖液B（5 mmol·L-1咪唑、0.35 mol·L-1NaCl、20 mmol·L-1Tris-HCl、pH 8.0）重懸，冰浴下超聲波破碎細(xì)胞。破碎后的裂解液10 000 r·min-1，4 ℃離心30 min。按照NI-NTA Purification System說明書提供的方法進行His標(biāo)簽親和純化。先以50 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，最后以250 mmol·L-1咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。將收集的洗脫液用透析柱濃縮除鹽，用SDS-PAGE分析目的蛋白的純度，用BCA法檢測目的蛋白的濃度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴增產(chǎn)物的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003在大約500、1 000和1 800 bp處分別有特異性單一PCR產(chǎn)物條帶，與預(yù)期大?。?68、1 044和1 755 bp）一致（圖1）。

圖1 pgn0523、pgn1187和pgn2003基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 1 Agarose gel electrophoresis results of PCR products of pgn-0523, pgn1187 and pgn2003 genes

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003在大約5 000 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期重組質(zhì)粒大小一致（圖2）。其PCR產(chǎn)物分別在大約500、1 000、1 800 bp處有特異性單一條帶，與3個目的基因大小一致（圖2）。將重組質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，將測序獲得的序列經(jīng)BLAST軟件與GenBank中的牙齦卟啉單胞菌ATCC33277國際標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列比對分析，結(jié)果表明二者為100%一致。

2.3 目的蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中，經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)2 h和6 h后，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，分別在19.5×103、39.9×103、66.0×103處可見一條明顯的蛋白質(zhì)增強條帶，與預(yù)期的3個目的蛋白大小相一致，說明目的蛋白得到成功誘導(dǎo)表達(dá)（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒及其PCR驗證產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 2 Agarose gel electrophoresis results of recombinant plasmids and PCR products

圖3 SDS-PAGE檢測目的蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果Fig 3 SDS-PAGE results of target proteins induced by IPTG

2.4 目的蛋白的親和純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌菌體經(jīng)過超聲波裂解、鎳離子金屬親和層析柱純化以及Millipore透析柱濃縮除鹽后，成功獲得了較高濃度和純度的目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化得到的蛋白與預(yù)期目的蛋白分子量一致（圖4）。BCA法測定目的蛋白的濃度分別為0.708、0.523和0.861 mg·mL-1。

圖4 SDS-PAGE檢測目的蛋白組氨酸標(biāo)簽親和純化結(jié)果Fig 4 SDS-PAGE results of purified His-tag proteins

3 討論

2008年，Karl-Peter Hopfner團隊在枯草芽孢桿菌中做DNA完整性掃描蛋白A（DNA integrity scanning protein A，DisA）的晶體結(jié)構(gòu)時意外發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)式核苷酸第二信使分子c-di-AMP[1]。c-di-AMP在細(xì)菌和支原體中廣泛存在，且可調(diào)控多種細(xì)菌生理活動，包括芽孢的產(chǎn)生、細(xì)菌耐藥性、細(xì)胞大小的調(diào)節(jié)、刺激宿主免疫系統(tǒng)等[13-15]。Witte等[1]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌中DAC結(jié)構(gòu)域具有二核苷酸環(huán)化酶活性。通過此結(jié)構(gòu)域，DisA蛋白可將ATP轉(zhuǎn)化為c-di-AMP，且與其他核苷酸相比，其更傾向于以ATP為底物。DAC結(jié)構(gòu)域不僅存在于枯草芽孢桿菌中，其在細(xì)菌和支原體中廣泛分布。c-di-AMP的分解蛋白是YybT，其是一個跨膜蛋白，具有3個功能性部分：與血紅素相連的PAS（Per-ARNT-Sim）端，中間的GGDEF（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe）結(jié)構(gòu)以及具有磷酸二酯酶活性的DHH/DHHA1結(jié)構(gòu)域，因此該蛋白又稱為GdpP（a GGDEF domain protein containing PDE）[7]。分解c-di-AMP的主要結(jié)構(gòu)域是DHH/DHHA1，其可將c-di-AMP分解為pApA[16]。

牙周炎是一種侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性炎癥性疾病[17]，其主要特征為牙周袋形成以及袋壁炎癥、牙槽骨吸收和牙齒逐漸松動脫落。目前，我國慢性牙周炎發(fā)病率高達(dá)80%以上，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因。此外，牙周炎與某些系統(tǒng)性疾?。ㄓ绕淙硇云つw?。┑陌l(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎病變區(qū)域或活動部位最主要的優(yōu)勢菌。該菌的毒力主要體現(xiàn)在3個方面：1）通過菌毛、莢膜的黏附以及抗吞噬能力依附于宿主菌表；2）通過分泌牙齦素等細(xì)菌素破壞宿主免疫組織；3）通過一系列的調(diào)控作用來增加其他致病菌對宿主的毒力作用[19-20]。

NCBI數(shù)據(jù)庫顯示，牙齦卟啉單胞菌pgn0523基因序列編碼一個假定的c-di-AMP合成酶。pgn1187和pgn2003基因則分別編碼兩個潛在的c-di-AMP分解酶，其催化結(jié)構(gòu)域為DHH/DHHA1。本實驗根據(jù)已發(fā)布的牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的基因組序列設(shè)計出針對這3個基因的特異性PCR引物。通過PCR技術(shù)從牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的基因組DNA中擴增出基因pgn0523、pgn1187和pgn2003，將其克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建出原核重組表達(dá)載體pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始由正常的大腸桿菌序列所控制，因而融合蛋白通常較易獲得高效表達(dá)[21]。融合蛋白最后用Ni2+金屬親和層析法成功純化到3個較高濃度和純度的目的蛋白，從而探索出一套高效的構(gòu)建牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP代謝相關(guān)蛋白的原核表達(dá)體系。

實驗選用的原核表達(dá)菌株BL21(DE3)，帶有噬菌體lacI基因、lacUV5啟動子及T7 RNA聚合酶基因，只有在IPTG誘導(dǎo)下目的基因才開始轉(zhuǎn)錄，并缺乏純化過程中降解蛋白的Lon蛋白酶及OmpT外膜蛋白酶，使得目的蛋白能更加穩(wěn)定的存在。實驗所用的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a載體屬于pET載體系列，與許靜等[22]表達(dá)牙齦卟啉單胞菌FimA重組蛋白所使用的pET-15b載體相似。pET-28a具有卡那霉素抗性，N末端有6個組氨酸標(biāo)簽，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白，表達(dá)的融合蛋白含有6-His標(biāo)簽，可以被特異性吸附組氨酸的Ni2+金屬親和層析柱純化，得到較純的目的蛋白。His標(biāo)簽與其他標(biāo)簽相比有很多優(yōu)點，如相對分子質(zhì)量小，一般不會影響目的蛋白的功能；免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫和制備抗體；可以用Ni離子層析柱進行親和純化，目的蛋白純度高，操作簡單，成本低[23]。

本實驗通過克隆牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP代謝相關(guān)蛋白編碼基因pgn0523、pgn1187和pgn2003，首次成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到了3個較高濃度和純度的目的蛋白。最近，研究人員建立了體外檢測c-di-AMP的多項技術(shù)，這為今后進一步驗證和解析c-di-AMP代謝酶的催化機制提供了重要的技術(shù)保障。Bai等[9]通過高效液相色譜與質(zhì)譜連用的方法成功對結(jié)核分枝桿菌c-di-AMP代謝酶的活性進行了驗證。Zhou等[24]建立了高通量檢測c-di-AMP的甲氧檗因（Coralyne）法，通過檢測甲氧檗因與c-di-AMP形成復(fù)合物而產(chǎn)生的熒光變化來測定酶活性，并將該方法成功應(yīng)用于c-di-AMP合成酶抑制劑的高通量篩選。本課題組后續(xù)將分別采用上述兩種成熟的技術(shù)方法對獲得的蛋白質(zhì)活性進行驗證，并進一步通過對蛋白質(zhì)進行定點突變來鑒定調(diào)節(jié)其活性的關(guān)鍵氨基酸位點，為靶向牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP代謝酶的藥物篩選提供關(guān)鍵信息。本課題組曾多次嘗試構(gòu)建牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP合成酶編碼基因pgn0523的缺失突變株，然而由于其作為生存必需基因[25]而無法敲除；故本課題組計劃構(gòu)建c-di-AMP代謝相關(guān)基因的超表達(dá)菌株，用以進一步研究c-di-AMP作為第二信使分子調(diào)控牙齦卟啉單胞菌生命生理活動及毒力因子功能的分子機制，從而為牙周炎的有效防治提供新的理論依據(jù)。

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