田煥娜 王小杰 梁秀軍 陳 龍 劉蘭芳 李 欣＊

（1承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，承德067000；2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北067000）

膜聯(lián)蛋白A7（annexin A7，ANXA7）是膜聯(lián)蛋白家族成員，該家族成員具有廣泛的生物學(xué)功能，包括膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分化、凋亡、生長調(diào)節(jié)及鈣離子信號途徑等［1－2］。.ANXA7除具有該家族典型的磷脂結(jié)合特性、Ca2＋通道形成特性等外，其在多種腫瘤組織中出現(xiàn)了表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA7表達(dá)異常與前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤［5］以及多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤［6］的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在肝癌中，ANXA7的表達(dá)顯著增高與肝癌進展成正相關(guān)，當(dāng)抑制了ANXA7的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的移動和侵襲性顯著下降，細(xì)胞凋亡率增高，而且在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞，但是ANXA7在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制并不清楚。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞系HepG－2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后，HepG－2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制［7］。半乳糖凝集素家族成員galectin－3的高表達(dá)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，其具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

本研究在前期工作基礎(chǔ)上，采用人肝癌細(xì)胞系HepG－2細(xì)胞為研究對象，在抑制ANXA7表達(dá)后檢測galectin－3的表達(dá)改變；用PKC激活劑PMA處理ANXA7表達(dá)受抑的細(xì)胞，檢測ANXA7及PKC表達(dá)變化，為深入探索ANXA7在肝癌中的作用機制研究提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1.試劑和儀器設(shè)備

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、靶向ANXA7的siRNA、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；ANXA7單克隆抗體購自美國Sigma公司；galectin－3多克隆抗體購自福建邁新公司；PKC單克隆抗體購自美國abcam公司；PMA購自Enzolife公司；所用引物由上海生工科技有限公司合成；細(xì)胞總RNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)公司產(chǎn)品；細(xì)胞培 養(yǎng) 基 （Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）為美國GIBCO公司產(chǎn)品；蛋白定量試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；紫外分光光度計（Thermo labsystems Multiskan MK3）為 Thermo公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱（HERAceu150）為德國賀利氏公司產(chǎn)品。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

HepG－2細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM于5%CO2的37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

3.siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按2×105／孔種植于6孔板中，使細(xì)胞在24h達(dá)到40－70%的密度；將細(xì)胞分為siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書，按siRNA oligo 20pm／孔、脂質(zhì)體5μl／孔，分別將siRNAoligo和脂質(zhì)體加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液250μl中混勻，靜置5min。然后將兩液混合，室溫放置20min。將500μl脂質(zhì)體／siRNA混懸液逐滴加入培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染后6h更換含血清培養(yǎng)基。

4.Western blot

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；將蛋白質(zhì)變性后經(jīng)12%SDS－PAGE電泳，每泳道30μg。電泳后電轉(zhuǎn)膜（電轉(zhuǎn)緩沖液：Tris 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200mL），濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜；5% 脫脂奶粉／TBST溶液封閉2h，將膜浸入1∶1000稀釋的ANXA7鼠抗人單克隆抗體，4℃過夜；加入羊抗鼠二抗（1∶1000稀釋），室溫孵育2h；ECL檢測。同時檢測相應(yīng)細(xì)胞β－actin的表達(dá)作為內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染48h后用100ng／ml PMA處理24h，Western blot檢測各組細(xì)胞中ANXA7和PKC表達(dá)，步驟同上。應(yīng)用 Quantity One V4.52軟件進行結(jié)果分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值作為蛋白相對表達(dá)水平。

5.RT－qPCR反應(yīng)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA后，以其為模板使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。分別對目的基因和β－actin進行實時定量PCR檢測。參照Genebank上各基因序列的編碼區(qū)，由TAKARA公司設(shè)計引物：ANXA7上游引物5’aaaggtgctggcacagatgac 3’，下游引物為5’tggcccacaatagccagaag 3’，擴增的基因片段為176bp。galectin－3的基因序列（Genebank AB006780.1），設(shè)計引物：上游引物5’taacccacgcttcaatgagaacaa 3’，下游引物為 5’acaagtgagcatcattcactgcaac 3’，擴增的基因片段為179bp。β－actin為內(nèi)參，上游引物5’tggcacccagcacaatgaa 3’，下游引物為5’ctaagtcatagtccgcctagaagca 3’，擴增的基因片段長度為186bp。反應(yīng)體系20uL：SYBR PremixEx TaqⅡ（2×）10μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference DyeⅡ0.4μl，cDNA 模板1.48μl，ddH2O 6.52μl。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)。

6.統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1.Western blot檢測siRNA的干擾效果

轉(zhuǎn)染后48h，經(jīng) Western blot檢測結(jié)果顯示，siRNA干擾組中ANXA7表達(dá)較陰性對照組和空白對照組有明顯下降。圖1結(jié)果顯示siRNA顯著抑制了HepG－2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)。

圖1 Western blot法鑒定siRNA抑制ANXA7表達(dá)結(jié)果。1：siRNA干擾組；2：轉(zhuǎn)染陰性對照組；3：空白對照。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較，＊P＜0.05Fig.1Expression of ANXA7by western blot.1：siRNA interference group；2：negative control group；3：blank control group.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

2.RT－qPCR檢測siRNA的干擾效果

為了進一步驗證AXNA7siRNA對MGC－803細(xì)胞AXNA7蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制效果，我們再次采用RT－qPCR法在mRNA水平進行了檢測，結(jié)果見圖2

圖2 RT－qPCR法檢測 AXNA7mRNA表達(dá)結(jié)果。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較，＊P＜0.05Fig.2Expression of AXNA7mRNA by RT－qPCR.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

3.Western blot檢測galectin－3在 ANXA7表達(dá)抑制的HepG－2細(xì)胞中的表達(dá)

當(dāng)ANXA7的表達(dá)抑制效果確定后，Western blot法檢測各組細(xì)胞中g(shù)alectin－3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對照組和空白對照組相比較，siRNA干擾組中g(shù)alectin－3在蛋白水平表達(dá)顯著下降，如圖3所示。

圖3 Western blot法檢測HepG－2細(xì)胞ANXA7表達(dá)抑制后galectin－3的表達(dá)。1：siRNA干擾組；2：陰性對照組；3：空白對照組。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較，＊P＜0.05Fig.3Expression of galectin－3after ANXA7knockdown in HepG－2cells by western blot.1：siRNA interference group；2：negative control group：3：blank control group.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

4.RT－qPCR 檢測galectin－3在 ANXA7表達(dá)抑制的HepG－2細(xì)胞中的表達(dá)

為了進一步證實galectin－3在ANXA7表達(dá)抑制的HepG－2細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果，我們再次采用RT－qPCR法在mRNA水平進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin－3在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著下降，見圖4。

5.PMA處理后PKC及ANXA7在ANXA7表達(dá)抑制的HepG－2細(xì)胞中的表達(dá)

將siRNAoligo轉(zhuǎn)染HepG－2細(xì)胞后48h，用終濃度為100ng／mL的PMA處理24h，Western blot法檢測siRNA干擾組，陰性對照組和空白對照組HepG－2細(xì)胞以及相對應(yīng)各組加藥處理后的細(xì)胞中PKC及ANXA7的表達(dá)，結(jié)果顯示在六組細(xì)胞中PKC的表達(dá)無顯著改變；與陰性對照組和空白對照組相比，siRNA干擾組ANXA7表達(dá)顯著降低；與（陰性對照＋PMA）組和（空白對照＋PMA）組相比，（siRNA干擾＋PMA）組中ANXA7表達(dá)顯著降低；PMA處理前后各組細(xì)胞中ANXA7表達(dá)無顯著差異。如圖5所示。

圖4 RT－qPCR檢測galectin－3mRNA在 ANXA7表達(dá)抑制的細(xì)胞中的表達(dá)。1：siRNA干擾組；2：陰性對照組；3：空白對照組。siRNA干擾組與其它兩組細(xì)胞相比較，＊P＜0.05Fig.4Galectin－3mRNA expression in the ANXA7 knockdown cells by RT－qPCR.1：siRNA interference group；2：Negative control group；3：Blank control group.＊P＜0.05，compared with negative control group and blank control group

圖5 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染ANXA7并加PMA處理后細(xì)胞中PKC及ANXA7的表達(dá)。1：siRNA干擾組；2：陰性對照組；3：空白對照組。4：PMA處理的siRNA干擾組；5：PMA處理的陰性對照組；6：PMA處理的空白對照組。Fig.5PKC and ANXA7expressing after transfection siRNA and PMA treatment by Western blot.1：siRNA interference group；2：Negative control group；3：Blank control group；4：siRNA interference and PMA treatment group；5：Negative control and PMA treatment group；6：blank control and PMA treatment group.

討 論

膜聯(lián)蛋白家族是Ca2＋依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族，該家族在細(xì)胞內(nèi)含量豐富，約占總蛋白量的1%－2%，參與細(xì)胞內(nèi)許多重要的生物學(xué)過程。ANXA7是膜聯(lián)蛋白家族最早發(fā)現(xiàn)的一個成員［8］，研究發(fā)現(xiàn)，ANXA7在多種腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)異常，其表達(dá)失調(diào)與腫瘤進展和預(yù)后密切相關(guān)。通過對乳腺腫瘤樣本的大量分析，ANXA7的表達(dá)顯著增高，而且ANXA7表達(dá)越高，患者存活率越低［4］；肺癌組織芯片結(jié)果顯示，在高分級的腫瘤中ANXA7高表達(dá)，并與低生存率相對應(yīng)［4］。當(dāng)抑制了ANXA7的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的移動和侵襲性顯著下降，細(xì)胞凋亡率增高［9－10］，而且在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于低轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞［11］；我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制肝癌細(xì)胞系HepG－2細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)后，HepG－2細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制。本研究繼續(xù)使用肝癌HepG－2細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ?，探討ANXA7表達(dá)抑制后細(xì)胞發(fā)生增殖和凋亡改變的可能的機制。

研究發(fā)現(xiàn)ANXA7可通過和galectin－3相互作用調(diào)控細(xì)胞的抗凋亡活性［12］。galectin－3是半乳糖凝集素家族成員，是一種可見于胞核、胞漿以及細(xì)胞外環(huán)境的多功能腫瘤抑制蛋白，它參與細(xì)胞黏附、免疫調(diào)節(jié)、新血管形成及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程。在凋亡誘導(dǎo)劑作用下，galectin－3轉(zhuǎn)位至核周膜，富集于線粒體并防止其被破壞和細(xì)胞色素C的釋放，對多種腫瘤細(xì)胞具有抗凋亡作用［13］，使用siRNA干擾ANXA7mRNA時，ANXA7表達(dá)下調(diào)，galectin－3便不能轉(zhuǎn)移到核周膜，這提示ANXA7在galectin－3的運輸中發(fā)揮了作用。我們在抑制ANXA7表達(dá)后，在蛋白水平和RNA水平分別檢測了galectin－3的表達(dá)，結(jié)果顯示galectin－3的表達(dá)顯著降低。由此我們推測抑制ANXA7表達(dá)導(dǎo)致HepG－2細(xì)胞增殖抑制可能和galectin－3的表達(dá)降低有關(guān)。

研究證實ANXA7還具有Ca2＋激活的GTP水解酶活性，并且隨著胞內(nèi)顆粒的向外分泌活性加強［14］。Ca2＋，GTP和PKC共同使 ANXA7具有促進胞吐過程中細(xì)胞膜融合的活性［15］。PKC不僅是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要信號分子，也是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞黏附、運動、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。有研究表明，PMA長時間處理細(xì)胞對PKC的調(diào)節(jié)存在組織和細(xì)胞特異性。我們在抑制ANXA7表達(dá)后，根據(jù)文獻報道用100ng／ml PMA處理細(xì)胞24h，在蛋白水平檢測了PKC和ANXA7的表達(dá)，結(jié)果顯示與未處理組相比PKC及ANXA7的表達(dá)無顯著差異。我們推測單獨激活PKC并不能引起ANXA7表達(dá)顯著變化。我們將用不同時間點及不同濃度PMA處理細(xì)胞來檢驗該推測是否準(zhǔn)確。此外，出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能有諸多因素共同作用，具體原因有待于我們繼續(xù)研究。

基于以上實驗結(jié)果，結(jié)合galectin－3具有抗腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，我們推測，抑制ANXA7表達(dá)導(dǎo)致HepG－2細(xì)胞增殖抑制的機理有可能是通過下調(diào)galectin－3的表達(dá)而導(dǎo)致，其具體機制亟待我們進一步深入研究解決。

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