堯 青 鄭 東 陳紅光

（湖北科技學院糖尿病心腦血管病變重點實驗室，咸寧437100）

糖尿病腦病作為糖尿病獨立的一個并發(fā)癥已被 醫(yī)學界所公認，并逐漸成為基礎(chǔ)和臨床等相關(guān)學科的研究熱點。大量的流行病學研究表明不受控制的糖尿病會導致輕度的認知功能障礙，增加阿爾茨海默病的風險［1－3］。海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，通過腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)系統(tǒng)和皮質(zhì)下行纖維接受來自視、聽、痛、觸等多種感覺信息，參與外界信息向中樞傳導的整合，是研究大腦學習記憶功能的理想模型。有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖一個月時腦顳葉皮層、海馬等區(qū)域內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯微血管病變，但神經(jīng)元已出現(xiàn)退行性改變［4］，可見海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化與糖尿病所致的認知功能障礙等腦部病變密切相關(guān)。許多研究表明，姜黃屬中具有降脂、抗氧化、抗炎、抗微生物等多方面藥理作用的一種黃色酚類化合物——姜黃素（Curcumin，Cur）對糖尿?。?］及其常見并發(fā)癥［6－10］有保護作用，然而它在糖尿病腦部病變中的治療作用研究還比較少，因此通過檢測大鼠海馬神經(jīng)元中凋亡相關(guān)因子Bcl－2，Bax和caspase－3的表達情況，觀察姜黃素對STZ誘導的2型糖尿病大鼠海馬是否有抗凋亡的保護作用，為糖尿病腦部病變的研究和治療提供一些實驗依據(jù)。

材料和方法

1.實驗動物和試劑

健康雄性SD大鼠100只，體重100－160g，購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心。STZ（Sigma公司，貨號 S0130），兔抗 Bcl－2抗體（sigma公司，貨號SAB4500003），兔抗Bax抗體（Abcam公司，貨號ab16837），兔抗caspase－3抗體（Abcam 公司，貨號ab59388），免疫組化試劑盒（谷歌生物，貨號G1003－2，包括HRP標記的二抗和DAB）。

2.模型制備及分組

實驗動物均飼養(yǎng)于SPF動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予20只大鼠正常飲食作為生理鹽水對照組（Con租），給予80只大鼠高糖高脂飼料（由普通飼料加20%豬油和10%白糖組成）飲食作為糖尿病模型組（DM組）和姜黃素處理的模型組（DM＋Cur組）。4周后，Con組繼續(xù)給予正常飲食，DM組和DM＋Cur組大鼠通過腹腔注射STZ 35mg／kg來復制2型糖尿病模型。STZ注射72h后尾靜脈采血測血糖，以隨機血糖濃度≥16.7mmol／L作為糖尿病模型建立的成功標準。DM造模成功后，DM組大鼠繼續(xù)喂以高糖高脂飲食，DM＋Cur組大鼠則給予高糖高脂飼料和姜黃素300mg／kg／天（姜黃素由1%的羧甲基纖維素鈉（Na－CMC）配制，放入大鼠的水瓶中讓其飲用）處理。實驗過程中，監(jiān)測大鼠體重及攝食量。姜黃素處理16周后，處死大鼠，檢測后續(xù)相關(guān)指標。

3.免疫印跡（Western Blot，WB）檢測

各組大鼠處死后，迅速于冰上取海馬以0.1g組織加1ml蛋白裂解液的比例提取組織蛋白。根據(jù)常規(guī)的WB流程檢測各組大鼠大腦海馬中Bcl－2和Bax的蛋白含量：先用60～80V的電壓進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，然后將目的蛋白于250mA恒流轉(zhuǎn)膜80min轉(zhuǎn)移至PVDF膜；TBST溶液洗膜5min×3次；5%脫脂牛奶室溫封閉2h；兔抗一抗（1：1000）于4℃孵育膜過夜；TBST溶液洗膜10min×3次；HRP標記的山羊抗兔IgG（1：5000）室溫孵育膜1h；TBST溶液洗膜10min×4次；增強化學發(fā)光（ECL）顯影成像，條帶用Quatity One軟件進行分析。

4.免疫組織化學（IHC）檢測

各組大鼠處死后，迅速取腦置于4%甲醛溶液中固定12－24h，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸潤并包埋成塊，石蠟切片機上行連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，貼于明膠載玻片上。切片的免疫組織化學檢測，按常規(guī)免疫組化SP法操作：切片脫蠟水化；0.1%Triton X100破膜；微波修復；0.3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化氫酶；5%BSA封閉后滴加一抗4℃過夜，兔抗caspase－3抗體1∶700；然后用 HRP標記的羊抗二抗室溫孵育45－60min后行DAB顯色。染色過程中各步驟之間均用PBS充分漂洗。顯色完后用蘇木素復染，然后脫水、透明、中性樹膠封片，在Olympus BX 53顯微鏡下觀察、攝片。免疫染色對照試驗用PBS代替一抗，其余步驟相同。

5.顯微圖像分析和統(tǒng)計學處理

各組實驗動物免疫染色切片均于Olympus BX53顯微鏡下用DP73高清成像系統(tǒng)進行掃描拍攝，圖片用Image－Pro－Plus 6.0軟件計數(shù)陽性顯色的累計光密度值（IOD值）。WB條帶均用Quatity One軟件進行分析，計數(shù)條帶灰度值。實驗數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行分析。

結(jié) 果

1.姜黃素對糖尿病大鼠體重和血糖的影響

各組大鼠在處死前檢測體重和隨機血糖，結(jié)果如表1所示：大鼠在SPF動物房的良好環(huán)境里飼養(yǎng)二十多周以后，Con組體重增加很多，達到700.2g，但是血糖一直正常。DM組在給STZ之前，體重增加迅速，給予STZ造模成功后，食量減少，同時出現(xiàn)多飲和多尿癥狀，大鼠漸漸消瘦，體重下降，并且隨機血糖增高，在處死前，平均血糖達到21.04mmol／L；給予DM大鼠姜黃素處理16周后，總體狀態(tài)比DM組好，體重減弱沒有DM組明顯，隨機血糖也比DM組大鼠低，到大鼠處死前，DM＋Cur組大鼠隨機血糖為16.95mmol／L，這些數(shù)據(jù)表明姜黃素能從總體 上改善大鼠的糖尿病癥狀。

表1 各組大鼠體重和隨機血糖的比較（mean±SD）Table 1 The comparation of body weight and random blood glucose in each group rats（mean±SD）

2凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2／Bax的WB檢測結(jié)果

各組實驗大鼠大腦海馬的WB檢測結(jié)果如圖1所示，大鼠海馬組織Bcl－2和Bax蛋白的表達水平呈負相關(guān)。與對照Con組相比，DM組Bcl－2蛋白表達降低而Bax蛋白表達顯著升高；與DM組相比，DM＋Cur組Bcl－2蛋白表達明顯升高而Bax蛋白表達降低（圖1A）。根據(jù) WB條帶分析得出的Bcl－2／Bax比值的比較見圖1B。

圖1 A：各組大鼠大腦海馬Bcl－2和Bax的WB條帶圖；B：Bcl－2／Bax的WB統(tǒng)計分析圖。＊ 與Con組相比P＜0.05，＃ 與DM組相比P＜0.05。Fig.1A：The WB bands of Bcl－2and Bax in each rats hippocampus；B：The WB statistical analysis chart of Bcl－2and Bax.＊compared with Con group，P＜0.05，＃compared with DM group，P＜0.05.

3caspase－3的IHC檢測結(jié)果

各組實驗大鼠大腦海馬caspase－3的IHC顯色結(jié)果如圖2所示，Con組大鼠海馬CA1，CA3和齒狀回（DG）均只有較低水平的caspase－3表達，而DM組大鼠海馬各區(qū)的caspase－3陽性表達均較Con組明顯增強，給于DM組大鼠姜黃素處理16周以后，海馬caspase－3陽性表達明顯減弱，可見姜黃素對DM大鼠的海馬有抗神經(jīng)元凋亡的作用。

討 論

姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術(shù)等的根、塊莖等處提取的一種黃色酚類化合物，原用做調(diào)味劑和食物色素，現(xiàn)代藥理學研究表明它具有降脂、

抗氧化、抗炎、抗微生物等多方面的藥理作用。近年來，關(guān)于姜黃素對糖尿?。?］及其并發(fā)癥如糖尿病腎?。?，7］、糖尿病心臟病變［8，9］、糖尿病眼部病變［10］等的治療作用的一些基礎(chǔ)和臨床研究已引起國內(nèi)外的重視。姜黃素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的積極藥理作用也有 很 多 研 究，如 AD［11－13］、PD［14］、癲 癇［15］、腦 缺血［16］等。然而它在糖尿病腦部病變中的治療作用研究還比較少，因此本文以姜黃素為目標藥物，通過檢測糖尿病大鼠大腦海馬神經(jīng)元中的凋亡調(diào)控蛋白Bcl－2與Bax和凋亡關(guān)鍵蛋白caspase－3的表達情況，研究姜黃素對糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元的抗凋亡保護作用。

圖2 A：各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)，CA3區(qū)和齒狀回caspase－3的IHC顯色圖（×200倍）；B：各組大鼠IHC顯色后的統(tǒng)計分析圖。＊與Con組相比P＜0.05；＃與DM組相比P＜0.05.Fig.2A：The immunoreactivity of caspase－3in hippocampal CA1，CA3，and dentate gyrus areas in each group（×200）；B：The IHC statistical analysis chart of caspase－3in each group rats.＊compared with Con group，P＜0.05，＃compared with DM group，P＜0.05.

在細胞凋亡過程中，有很多蛋白和細胞因子參與調(diào)控，其中，Bcl－2蛋白家族是調(diào)節(jié)線粒體通透性的主要成分，可通過形成同源（Bcl－2／Bcl－2，Bax／Bax）和異源（Bcl－2／Bax）二聚體對線粒體細胞凋亡途徑進行調(diào)控。Bcl－2同源二聚體抑制細胞凋亡，Bax同源二聚體促進細胞凋亡。另外一個對細胞凋亡起重要調(diào)控作用的是caspase家族，它們是引起細胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號途徑激活，能將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細胞不可逆的走向死亡。幾乎所有的細胞凋亡都會有這些調(diào)控因子的參與，因此，可以通過對這些調(diào)控因子定性定量的檢測，來反映細胞凋亡的程度。

本研究通過檢測各組實驗大鼠細胞凋亡途徑中的Bcl－2、Bax和caspase－3表達情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病大鼠海馬組織中的Bcl－2蛋白含量減少，而Bax蛋白含量升高，Bcl－2／Bax比值較Con組明顯減少，可見DM組大鼠海馬中異源（Bcl－2／Bax）二聚體和Bax同源二聚體的比例升高，更多的促進細胞凋亡的發(fā)生，同時通過IHC法對海馬各區(qū)caspase－3檢測發(fā)現(xiàn)，DM組caspase－3陽性表達明顯增強，進一步驗證了DM組凋亡發(fā)生的增多。而給予姜黃素處理DM組大鼠16周后，促凋亡的各指標表達都有下降，而抗凋亡蛋白Bcl－2水平升高，由此可見，姜黃素對DM組大鼠大腦海馬神經(jīng)元有抗凋亡的保護作用，這種保護作用可能與姜黃素的抗炎抗氧化作用相關(guān)［17－19］。

糖尿病腦病患者的認知功能障礙是多種因素參與的復雜病理過程，到目前為止，其作用機制也未完全闡明，治療更是缺乏安全有效的藥物，現(xiàn)在姜黃素對糖尿病的治療作用已引起廣泛重視，并被制成膠囊制劑試驗其降糖效果，如果其降糖抗氧化等藥理作用可以防治糖尿病腦病，將對糖尿病腦病患者的防治帶來新的方向。我們的研究也證實姜黃素對STZ誘導的2型糖尿病模型大鼠海馬有抗凋亡的保護作用，希望能更進一步研究其具體機制，為糖尿病腦病的研究和治療帶來新的依據(jù)，為姜黃素的治療作用提供科學基礎(chǔ)。

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