恐懼記憶的形成對大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層ECoG的影響

恐懼記憶的形成對大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層ECoG的影響

黃思佳，隨力，任杰，彭彬彬，宋小金

上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院(上海，200093)

上海市教委科研創(chuàng)新項目(12ZZ143)

通信作者：隨力，教授，E-mail：lsui@usst.edu.cn

【摘要】目的記錄并分析大鼠在穿梭實驗恐懼記憶形成前后內(nèi)側(cè)前額葉皮層的皮層腦電(Electrocorticogram，ECoG)的變化特征，揭示恐懼記憶的形成對內(nèi)側(cè)前額葉皮層ECoG的影響。方法通過穿梭實驗誘導(dǎo)出大鼠對厭惡刺激的恐懼記憶，在恐懼記憶形成前后分別記錄大鼠處于清醒和淺麻醉狀態(tài)下內(nèi)側(cè)前額葉皮層的ECoG，分析ECoG頻率譜、功率譜的變化特征。結(jié)果不論大鼠是處于清醒狀態(tài)還是淺麻醉狀態(tài)，恐懼記憶形成前后ECoG的總功率沒有顯著性差異(P>0.05)。盡管恐懼記憶的形成對于淺麻醉狀態(tài)下的ECoG的頻率譜沒有顯著性改變(P>0.05)，但恐懼記憶的形成對于清醒狀態(tài)下的ECoG的頻率譜具有顯著性的影響(P<0.05):表現(xiàn)為θ波比例顯著減少(P<0.05)，β波比例顯著增加(P<0.05)。實驗結(jié)果提示穿梭實驗恐懼記憶的形成使清醒狀態(tài)下的大鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮層處于興奮狀態(tài)。

【關(guān)鍵詞】恐懼記憶；ECoG；大鼠；穿梭實驗；內(nèi)側(cè)前額葉皮層

doi:10.3969/j.issn.1674-1242.2015.02.006

基金項目：國家自然科學(xué)基金(11179015, 51173108)；

作者簡介：黃思佳，碩士研究生，E-mail:18914499152@163.com

【中圖分類號】R319

【文獻標(biāo)志碼】A

文章編號：1674-1242(2015)02-0086-05

Abstract【】ObjectiveThe aim of this study is to investigate the effects of fear memory formation on electrocorticogram (ECoG) in rat prefrontal cortex.MethodsShuttle box test was used to induce fear memory in rats. Electrophysiological ECoG recordings of rat prefrontal cortex were monitored before and after fear memory forming in the awaked and the anesthetized condition, respectively. The total power spectra and the frequency spectra of these ECoG were analyzed and compared.ResultsFear memory formation did not significantly alter the total power of ECoG in the prefrontal cortex, whether in the awaked or in the anesthetized rats (P>0.05). Furthermore, in the awaked rats, significant differences in the frequency distribution of ECoG were found following fear memory formation relative to before memory formation, with the evidence that the ratios of θ wave is decreased and the ratios of β wave is increased(P<0.05). Whereas, in the anesthetized rats, fear memory formation failed to affect the frequency spectra of ECoG in the prefrontal cortex (P>0.05). These findings indicated that fear memory formation excited the prefrontal cortex in the awaked rats.

收稿日期：(2015-03-15)

Effects of Fear Memory Formation on ECoG in Rat Prefrontal Cortex

HUANG Sijia, SUI Li, REN Jie, PENG Binbin, SONG Xiaojin

School of Medical Instrumentation and Food Engineering,

University of Shanghai for Science and Technology (Shanghai, 200093)

【Key words】fear memory，electrocorticogram，rat，shuttle box test，prefrontal cortex

0　引言

將電極植入到大腦皮層的特定區(qū)域而記錄到的腦電圖，即為皮層腦電圖(Electrocorticogram, ECoG)。ECoG能直接反映大腦局部的電活動，信噪比高。使用ECoG電極，對大腦的影響比較小，不會損傷腦組織。目前ECoG的研究主要在癲癇患者或者動物身上進行研究。

學(xué)習(xí)與記憶是生物體生存的必要能力。對此研究不僅需要行為方面的研究，也依賴于在記憶過程中分子事件的細(xì)致分析[1]。條件性恐懼記憶是一種較重要的記憶類型，適當(dāng)?shù)目謶挚梢詭椭藗冓吚芎?，保護自己[2]。而紊亂的恐懼記憶、焦慮癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 (Post-Traumatic Stress Disorder，PTSD)等神經(jīng)性疾病與恐懼記憶有著密切的關(guān)系。因此，研究大腦認(rèn)知恐懼的神經(jīng)機制具有重要的理論意義和臨床意義[3]。

恐懼記憶的形成和內(nèi)側(cè)前額葉皮層、海馬及杏仁核腦區(qū)的激活有關(guān)。以往研究[4]表明，記憶保持與內(nèi)側(cè)前額葉皮層的活性密切相關(guān)。但尚無恐懼記憶的形成對ECoG的影響的研究報道。所以，在本次實驗研究中，將大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層的ECoG進行分析比較。

1　實驗對象與方法

1.1實驗對象

實驗采用健康成年雄性SD大鼠，購自上海斯萊克動物實驗中心。體重200±10 g，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，自然光照，動物房內(nèi)溫度 。

1.2實驗儀器與試劑

腦電記錄儀(上海諾誠電氣有限公司)；明暗穿梭箱(成都泰盟科技有限公司)；腦立體定位儀；牙托粉義齒基托樹脂液劑；牙托粉；顱骨鉆；碘酒；30%的雙氧水；戊巴比妥鈉。

1.3皮層電極的植入手術(shù)

大鼠以戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔麻醉，自然俯臥并固定于腦立體定位儀上，碘酒消毒皮膚，并沿著大鼠頭頂正中切開頭皮并進行鈍性分離，用30%的雙氧水去除多余的軟組織，露出前、后囟及冠、矢狀縫等骨性標(biāo)志[5]。采用顱骨鉆在內(nèi)側(cè)前額葉皮層(前囟前方2.7 mm～3.0 mm，旁開0.7 mm～1.0 mm)鉆孔，再將皮層記錄電極(直徑為1 mm的小螺絲)植入到指定位置。參考電極植入到小腦處。電極用牙科水泥固定。最后進行消毒防止術(shù)后腦感染。術(shù)后恢復(fù)7 d，選取正常飲食、無萎靡不振的大鼠進行ECoG測量。

1.4大鼠穿梭恐懼記憶形成訓(xùn)練方案

將術(shù)后恢復(fù)正常的大鼠放入明暗穿梭箱的明箱中，由于大鼠喜黑特性而很快進入明暗穿梭箱的暗箱內(nèi)。只要大鼠四肢全部進入暗箱中，即給予1.5 mA的足部電刺激，大鼠因足部電擊的疼痛而進入明箱。僅需刺激多次，大鼠在明箱中的時間超過30 min，認(rèn)為它產(chǎn)生了恐懼記憶。明暗穿梭實驗結(jié)束，大鼠移入飼養(yǎng)籠內(nèi)。

1.5大鼠穿梭恐懼記憶形成前后ECoG記錄與分析

在恐懼記憶形成訓(xùn)練24 h后，再次對大鼠測試，確保大鼠形成恐懼記憶。大鼠形成恐懼記憶前后，均要測兩組ECoG 數(shù)據(jù)，一組是大鼠處于淺麻醉狀態(tài)，另一組是大鼠處于清醒的狀態(tài)。在測腦電前，將諾誠腦電的儀器與電極相連接。運行諾誠腦電的采集軟件。采樣頻率為128 Hz，共持續(xù)30 min。選取6只大鼠的內(nèi)側(cè)前額葉皮層電極點，并將每種狀態(tài)比較穩(wěn)定的100 s進行分析處理。

采集到的信號首先進行格式轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入MATLAB軟件，運用小波工具箱的小波變換(Wavelet Transform)以進行濾波，頻率譜分析范圍為0～30 Hz。然后用MATLAB進行頻域分析，對比大鼠在不同狀態(tài)下頻譜曲線差異。計算大鼠在不同狀態(tài)下ECoG 的總功率和功率譜中δ、θ、α和β頻段的功率百分比。ECoG各頻段的頻率范圍是δ：1～4 Hz，θ：4～8 Hz，α：8～13 Hz，β：13～30 Hz[6]。正常情況下，在清醒、安靜、閉目時，波幅呈現(xiàn)由小變大，再由大變小，如此反復(fù)進行，形成所謂α節(jié)律的“梭形”。當(dāng)睜眼、警覺、思考問題或接受其他刺激時，α波立即消失而代之以快波，這種現(xiàn)象稱之為“α波阻斷”。一般認(rèn)為，α波是大腦皮質(zhì)處于清醒安靜狀態(tài)時電活動的主要表現(xiàn)。β波的出現(xiàn)意味著大腦比較興奮。θ波是在困倦時，神經(jīng)系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)時所記錄的波形。δ波在睡眠、深度麻醉、缺氧或大腦有器質(zhì)性病變時出現(xiàn)[7]。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2　結(jié)果

2.1大鼠4種不同狀態(tài)下的ECoG

本實驗選取了大鼠在穿梭實驗恐懼記憶形成前的淺麻醉和清醒的ECoG和恐懼記憶形成后的淺麻醉和清醒的ECoG。4種不同狀態(tài)下的ECoG分別為：訓(xùn)練前，即恐懼記憶形成前，大鼠的清醒狀態(tài)下的ECoG(圖1A);訓(xùn)練后，即恐懼記憶形成后，大鼠的清醒狀態(tài)下的ECoG(圖1B);訓(xùn)練前，即恐懼記憶形成前，大鼠的淺麻醉狀態(tài)下的ECoG(圖1C)；訓(xùn)練后，即恐懼記憶形成后，大鼠的淺麻醉狀態(tài)下的ECoG(圖1D)。

圖1大鼠在不同狀態(tài)下的ECoG

Fig.1 ECoG of rats at different state

2.2大鼠不同狀態(tài)下頻率譜的變化

大鼠足部穿梭實驗恐懼記憶形成前后處于清醒狀態(tài)時，ECoG頻率譜會發(fā)生明顯的變化?？謶钟洃浶纬汕?，清醒狀態(tài)下放電頻譜能量較高部分主要集中在低頻部分(1～12 Hz頻段)，占總功率的65.69%(圖2A)；而形成恐懼記憶后，清醒狀態(tài)下高能量放電頻率分配發(fā)生顯著變化，集中分布在(4～16 Hz頻段)，占總功率的67.81%(圖2B)。大鼠足部電刺激前后在淺麻醉狀態(tài)下的頻譜圖非常相似(圖2C、圖2D)。放電頻譜能量較高部分主要集中在低頻和中頻段，可以看到兩組淺麻醉狀態(tài)頻譜圖都有兩個峰值。由于在做實驗給大鼠的麻醉不是非常深，所以出現(xiàn)了大幅值的[8]。在大鼠形成穿梭實驗恐懼記憶后清醒狀態(tài)下出現(xiàn)了α波阻斷(圖3)。

圖2大鼠在不同狀態(tài)下ECoG頻譜比較示意圖

Fig.2Comparison of ECoG frequency spectrum at different State

圖3恐懼記憶形成前后的α波

Fig.3α wave before and after the formation of fear memory

2.3不同狀態(tài)下的功率譜特征的變化

2.3.1大鼠在各種情況下的ECoG總功率的變化

表1　大鼠在形成恐懼記憶前后清醒

從表1可以發(fā)現(xiàn)，恐懼記憶形成前后清醒狀態(tài)下的ECoG的總功率經(jīng)過等方差T檢驗，發(fā)現(xiàn)并無顯著差異(P>0.05)?？謶钟洃浶纬汕暗那逍雅c淺麻醉狀態(tài)的ECoG總功率也無顯著差異(P>0.05)。同樣地，形成恐懼記憶后淺麻醉狀態(tài)下的ECoG總功率與形成恐懼記憶前淺麻醉狀態(tài)下的ECoG的總功率也無顯著差異(P>0.05)。表1的結(jié)果表明恐懼記憶形成前后各種狀態(tài)的總功率均無顯著性差異。

2.3.2穿梭實驗恐懼記憶形成前后各狀態(tài)ECoG功率譜的變化

6只大鼠恐懼記憶形成前、清醒狀態(tài)下的功率譜能量百分比見表2；6只大鼠恐懼記憶形成后、清醒狀態(tài)下的功率譜能量百分比見表3；6只大鼠恐懼記憶形成前、淺麻醉狀態(tài)下的功率譜能量百分比見表4；6只大鼠恐懼記憶形成后、淺麻醉狀態(tài)下的功率譜能量百分比見表5。圖4則是直接客觀的反映了表2、3、4、5的情況?？謶钟洃浶纬珊笄逍褷顟B(tài)(Fig.4B)與恐懼記憶形成前清醒狀態(tài)(Fig.4A)相比：大鼠在恐懼記憶形成后清醒狀態(tài)下功率譜θ頻率能量所占能量總功率比例顯著降低(tStat=2.69，P<0.05)，而β頻率能量所占能量總功率比例顯著增加(tStat=-2.31，P<0.05)；穿梭恐懼記憶形成前淺麻醉狀態(tài)(Fig.4C)相對于清醒狀態(tài)(Fig.4A)，θ頻率能量占能量總功率顯著降低(tStat=3.70，P<0.05)，功率譜α頻率能量所占能量總功率降低，但不顯著(tStat=2.10，P=0.06>0.05)，功率譜β頻率能量所占能量總功率比例顯著增加(tStat=-3.78，P<0.05);從圖4中可以看出形成恐懼記憶前后淺麻醉狀態(tài)(Fig.4C，F(xiàn)ig.4D)各波段頻率能量均無太大變化。

表2　形成恐懼記憶前清醒狀態(tài)功率譜變化

表3　形成恐懼記憶后清醒狀態(tài)功率譜變化

表4　形成恐懼記憶前淺麻醉狀態(tài)功率譜變化

表5　形成恐懼記憶后淺麻醉狀態(tài)功率譜能量百分比

圖4各狀態(tài)功率譜百分比變化柱狀圖

Fig.4Different percentage of ECoG

frequency spectrum at different state

注：形成恐懼記憶前清醒與形成恐懼記憶后清醒相比：*P<0.05；形成恐懼記憶前清醒與形成恐懼記憶前淺麻醉相比：△P<0.05。A：恐懼記憶形成前、清醒狀態(tài)；B：恐懼記憶形成后、清醒狀態(tài)；C：恐懼記憶形成前、淺麻醉狀態(tài)；D：恐懼記憶形成后、淺麻醉狀態(tài)。

3　討論

腦電圖(EEG)是腦生理特征的客觀反應(yīng)，是檢驗和預(yù)測腦電生理變化的重要依據(jù)，目前在記憶方面也有了一定的進展[9]。但是，由于腦電圖特殊的導(dǎo)聯(lián)方式，信號記錄需要在受試者頭部相對靜止的狀態(tài)下進行。但是在本實驗中大鼠受到足部電刺激后，會因為恐懼出現(xiàn)逃竄這種現(xiàn)象，所以身體的震動又不可避免的會對記錄信號產(chǎn)生干擾。因此采用皮層腦電(ECoG)的方法，將記錄電極與顱骨的位置相對固定，最大限度地減少大鼠本身的行為所造成的電極與記錄單元的相對運動而產(chǎn)生的信號干擾，一定程度上克服了EEG記錄方法的局限，以便更好地揭示恐懼記憶對ECoG的影響。

ECoG分析的主要觀察指標(biāo)為功率譜和頻率譜，功率譜可以反映大腦在不同狀態(tài)下腦電信號能量的大小及其各個頻譜段上的分布情況。功率譜分析是經(jīng)典的腦電分析方法之一[10]。本文實驗結(jié)果：穿梭實驗恐懼記憶形成前后的清醒、麻醉狀態(tài)下大鼠ECoG信號總功率無明顯變化，說明恐懼記憶形成前后大腦的電活動沒有顯著變化。大鼠進行足部穿梭實驗前，相對于清醒的淺麻醉狀態(tài)β節(jié)律顯著上升，θ波節(jié)律顯著降低，α節(jié)律降低。

一般認(rèn)為，ECoG的功率譜頻率分配中，α和β波所占比率的顯著增加，而δ和θ頻段所占比率減少，反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增強，反之則說明中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性降低，而抑制性增強[11]。但本次實驗中大鼠在淺麻醉后發(fā)現(xiàn)為α節(jié)律降低，θ節(jié)律顯著降低，顯著上升。有研究報道，由于戊巴比妥鈉是無鎮(zhèn)痛的，大腦皮層仍是信息處理的最高級中樞，是痛覺形成的最終部位。而β頻段功率百分比對傷害性刺激引起的疼痛的反映具有特異性[12]。還有研究報道指出，麻醉開始后，腦電由正常的高頻低幅快節(jié)律轉(zhuǎn)變?yōu)榈皖l高幅慢節(jié)奏[13]。這也可能造成大鼠淺麻醉后ECoG的β所占比例增大。大鼠的淺麻醉狀態(tài)下β頻段功率百分比如此之高的另一個原因可能是麻醉量比較小，導(dǎo)致大鼠處于半清醒狀態(tài)下，使大腦沒有完全麻醉。

穿梭實驗恐懼記憶形成后清醒狀態(tài)下，相對于穿梭實驗恐懼記憶形成前清醒狀態(tài)下，θ節(jié)律顯著降低，β節(jié)律顯著上升，反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增強。哈特博士的研究小組發(fā)現(xiàn)了表示大腦對視覺威脅影響反應(yīng)的θ和β波活動[14]。這與本實驗結(jié)果還是比較一致的。

4　結(jié)論

大鼠經(jīng)過穿梭實驗訓(xùn)練后，形成了恐懼記憶。在淺麻醉狀態(tài)下，恐懼記憶形成對ECoG沒有顯著性變化；在清醒狀態(tài)下，雖然恐懼記憶對內(nèi)側(cè)前額葉皮層ECoG 的總功率沒有顯著性改變。但是功率譜θ頻率能量所占能量總功率比例顯著降低，而β頻率能量所占能量總功率比例顯著增加。實驗結(jié)果提示穿梭實驗恐懼記憶形成后，內(nèi)側(cè)前額葉皮層處于興奮狀態(tài)。

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