支大龍，敖 磊，王 宏，季維智，3，司 維，3*(1.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南昆明650093;2.云南中科靈長類生物醫(yī)學重點實驗室，云南昆明650500;3.昆明亞靈生物科技有限公司，生物醫(yī)學動物模型國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南昆明650500;.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，云南昆明650032)

靈長類動物是生物醫(yī)學研究中廣泛使用的實驗動物，由于其在生理生化和遺傳上與人類高度接近，因此成為研究人類疾病適宜的動物模型。然而，隨著人類對靈長類動物棲息地的破壞，其數(shù)量急劇下降。種質(zhì)資源的低溫保存為靈長類動物的遷地保護和生物多樣性保護提供了一條有效的途徑。目前，靈長類動物的精子冷凍保存的方法大多傾向于經(jīng)驗性，而且難以準確重復。食蟹猴是一類重要的靈長類實驗動物，其精子冷凍復蘇后往往受到冷凍損傷，復蘇后精子活力明顯下降，從而導致受精能力下降［1－3］。研究表明，不同類型的冷凍液對食蟹猴精子的冷凍保護作用存在差異，凍存后精子的復蘇活力也有明顯差異［4］。目前已報道的靈長類動物精子冷凍液中，卵黃作為非滲透性保護劑是主要成分之一，其使用濃度通常為10% ～20%［5－6］。通常認為卵黃主要是通過影響精子質(zhì)膜的相變而起到抗冷休克的左右［7］，起主要作用的可能是卵黃中的一類低密度脂蛋白，另外卵黃中的卵磷脂能穩(wěn)定精子細胞膜，防止頂體破裂，減輕冷凍引起的精子冷休克［8］。但是，由于卵黃的構(gòu)成成分較為復雜，使深入研究精子冷凍損傷的機制變得十分困難。此外，由于卵黃通常來源于家禽的蛋，可能攜帶一些潛在的傳染性病原體(病毒、細菌、支原體)［9－10］，這極大增加了對精子污染的風險，甚至影響精子的受精能力，導致應用冷凍精子開展體外受精和人工授精的成功率下降，并增加疾病傳播的風險。此外，不同來源的卵黃質(zhì)量參差不齊，其對精子的冷凍保護效果也就存在差異［11－12］，難以標準化。因此，建立高效、安全、質(zhì)量可控的無卵黃冷凍液及相應的冷凍降溫程序?qū)τ诶鋬鼍釉谳o助生殖方面的應用以及精子冷凍損傷機制的研究至關重要。除了冷凍液以外，冷凍降溫速率也是影響動物精子冷凍復蘇存活率的重要因素之一。每個物種精子冷凍保存的適宜冷凍降溫速率與使用的冷凍液種類和冷凍保護劑的濃度有關［13－15］?，F(xiàn)有的食蟹猴精子冷凍研究報道使用的降溫速率各不相同［3，16］，目前還未見到關于研究降溫速率對食蟹猴精子冷凍復蘇存活率的報道。

SpermCryoTMAll-round是應用于人類精子冷凍保存的商品化的無卵黃冷凍液［17］，該冷凍液采用甘油作為冷凍保護劑，使用該冷凍液保存人類精子的冷凍程序簡單，且冷凍液的質(zhì)量標準化已成功應用于人類精子的低溫保存［17］。然而，迄今為止尚未見到在靈長類動物的精子冷凍保存中使用SpermCryo的研究報道。因此，筆者選取食蟹猴作為試驗對象，以冷凍復蘇精子活力和頂體完整率作為精子功能狀態(tài)的檢測指標，使用SpermCryo冷凍液冷凍保存食蟹猴精子，研究在液氮蒸汽中冷凍降溫的時間以及不同的冷凍降溫速率對食蟹猴精子冷凍復蘇效率的影響，優(yōu)化冷凍方法，最終建立基于SpermCryo無卵黃冷凍液的食蟹猴精子冷凍保存的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4只雄性健康、可育的食蟹猴(年齡8～10歲)，來自通過國際AAALAC認證的昆明亞靈生物科技有限公司。每只食蟹猴單籠飼養(yǎng)，保持每天12 h光照、12 h黑暗，17～22℃室溫。實驗動物的使用和試驗方案通過了昆明亞靈生物科技有限公司動物使用和管理委員會(IACUC)的批準。

1.2 試劑 SpermCryoTMAll-round為商品化冷凍液(Provitro，F(xiàn)redericia，Denmark)。葡萄糖、乳糖和牛血清白蛋白(BSA)，均來自Sigma公司(St Louis，MO，USA)。冷凍麥管來自IMV Technologies公司(IMV，L’Aigle，F(xiàn)rance)?；ㄉ貋碜訫olecular Probes公司(Alexa Fluor-488-PNA，Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)。

1.3 精液的采集 雄猴通過肌肉注射鹽酸氯胺酮(4 mg/kg體重)麻醉，使用美國Grass公司產(chǎn)S44型方波發(fā)生器通過陰莖電刺激采集精液［18］。

1.4 降溫速率和解凍復溫速率的測定 精子冷凍的降溫速率和解凍復溫速率的測定方法參照以前的相關報道［16，19］。將食蟹猴精子冷凍液裝入0.25 ml的冷凍麥管中，然后將直徑0.25 mm的T型5SRTC-TT-T-30熱電偶(Omega Engieering，Inc.Stamford，CT，USA)的一端插入麥管中，另一端與 8-通道USB熱電偶數(shù)據(jù)采集模塊(TC-088，Omega Engieering，Inc.Stamford，CT，USA)相連接。將熱電偶數(shù)據(jù)采集模塊與微機相連，運行TC-088軟件，然后將冷凍麥管分別置于泡沫盒內(nèi)距液氮表面1、4和7 cm處收集每秒鐘的溫度變化，然后計算距液氮表面不同距離的冷凍降溫速率。同樣，將裝有熱電偶的冷凍麥管從－196℃液氮中直接投入37℃水浴中2 min中，利用熱電偶數(shù)據(jù)采集模塊收集數(shù)據(jù)，并計算解凍復蘇速率。

1.5 食蟹猴精子的冷凍保存和解凍復蘇 將采集的精液于37℃水浴中液化 30 min后，用含 0.15 mol/L乳糖、0.15 mol/L葡萄糖和0.3%BSA的溶液稀釋至終濃度7×106個/ml［20］，檢測新鮮精子活力和頂體完整率。然后，參照SpermCryo說明書的方法進行精子冷凍:室溫下加入Sperm-Cryo防凍液(精液與冷凍液比例為3∶1)，室溫靜置10 min。然后，再將精液裝入0.25 ml冷凍麥管封口后，將麥管分別至于液氮上方4 cm處降溫10和30 min后直接投入液氮中冷凍保存。精子復蘇時將麥管直接投入37℃水浴中2 min，并加以攪動使精子解凍復蘇。

1.6 精子功能的檢測

1.6.1 精子活力的檢測。分別取10 μl新鮮精子或冷凍復蘇精子樣本置于37℃預熱的Makler精子計數(shù)板上，在光學顯微鏡下記錄運動精子數(shù)，計算運動精子占精子總數(shù)的百分率，即為精子活力。每次至少計數(shù)200個精子，每份樣品計數(shù)2次，最后精子活力為2次計數(shù)所得的平均值。然后，按照以下公式計算精子冷凍復蘇率:精子冷凍復蘇率=冷凍后精子活力/鮮精精子活力×100%。

1.6.2 頂體完整率的檢測。將精子樣本涂片，放置于通風櫥內(nèi)平整的桌面上，于室溫下待其完全干燥;吸取無水乙醇滴加在涂片上，均勻完整地覆蓋涂片;待無水乙醇自然風干后，將涂片置于濕盒中，濕盒的四周和蓋子進行避光處理，并將濕盒置于37℃的溫臺上;將10 μg/ml的Alexa Fluor-488-PNA溶液滴加在涂片上，于37℃孵育30 min;用PBS將涂片表面的Fluor-488-PNA溶液沖洗掉;將涂片置于37℃的溫臺上，遮光并待其風干;將涂片置于熒光顯微鏡下檢測精子頂體完整性(發(fā)射光波長515 nm，激發(fā)光波長488 nm)。頂體完整的精子頭部被染成均勻的蘋果綠色，而發(fā)生了頂體反應的精子頭部則僅部分著色或不被染色。記錄頂體完整精子占精子總數(shù)的百分率。每次至少記錄200個精子。計數(shù)200個精子，計算頂體完整率［21］。

1.7 冷凍平衡時間對食蟹猴精子冷凍復蘇活力的影響 將采集的精液液化稀釋后，根據(jù)SpermCryo說明書，室溫下加入SpermCryo冷凍液，精液與冷凍液比例為3∶1，室溫下靜止10 min。再將精液裝入麥管封口后，將麥管分別置于液氮上方4 cm處降溫10和30 min。

1.8 降溫速率對食蟹猴精子冷凍復蘇活力的影響 采集的精液液化稀釋后，室溫下加入SpermCryo冷凍液，精液與冷凍液比例為3∶1，室溫靜止10 min。再將精液裝入麥管封口后，將麥管分別至于液氮上方1、4和7 cm處降溫，冷凍平衡時間采用較好的冷凍平衡時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍平衡時間對食蟹猴精子冷凍復蘇活力的影響 食蟹猴精子在距液氮面4 cm處分別冷凍平衡10和30 min，測定精子冷凍保存后的復蘇活力。從圖1可以看出，與新鮮精子相比，冷凍保存顯著降低了精子的活力(P＜0.05)。精子在液氮上方冷凍10和30 min存在顯著差異，用10 min冷凍平衡時間保存的精子復蘇活力顯著高于冷凍平衡30 min的精子復蘇活力(P＜0.05)。從圖2可以看出，與新鮮精子相比冷凍保存顯著降低了精子完整性(P＜0.05)。但是，精子在液氮上方冷凍平衡10和30 min中未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P ＞0.05)。

2.2 降溫速率對食蟹猴精子冷凍復蘇活力的影響 食蟹猴精子在距液氮面1、4、和7 cm處冷凍平衡10 min后投入液氮時的冷凍降溫速率度分別是－435、－183、和－69℃/min。精子從－196℃的液氮中轉(zhuǎn)至37℃水浴解凍復蘇的速率為1 200℃/min(表1)。由表1可知，與新鮮精子相比冷凍保存顯著降低了精子的活力(P＜0.05)。用快速冷凍(液氮面上方1 cm)和中速冷凍(液氮面上方4 cm)保存的精子復蘇活力顯著高于慢速冷凍(液氮面上方10 cm)(P＜0.05)，而在液氮上方1 cm和4 cm冷凍保存精子的復蘇活力沒有顯著差異(P＞0.05)。從圖3可以看出，與新鮮精子相比冷凍保存顯著降低了精子頂體完整性(P＜0.05)，但是精子的頂體完整性在不同的降溫速率的各組之間沒有顯著差異(P ＞0.05)。

表1 不同降溫速率對的食蟹猴精子冷凍前后復蘇活力的影響

3 討論

SpermCryo冷凍液已經(jīng)成功應用于人類精子的冷凍保存，該產(chǎn)品推薦采用的液氮蒸汽冷凍平衡時間為30 min［17］。研究表明，液氮蒸汽冷凍平衡時間可以對獼猴精子冷凍保存復蘇活力產(chǎn)生影響［16］。然而，食蟹猴冷凍保存中冷凍平衡時間對食蟹猴精子冷凍保存復蘇活力的影響尚不清楚。研究表明，在胞內(nèi)開始形成冰核時細胞外的滲透壓已經(jīng)升高10倍［22］。因此，冷凍降溫過程中食蟹猴精子冷凍平衡時間可能會影響胞內(nèi)冰晶形成，從而造成精子的冷凍損傷。筆者通過采用在液氮蒸汽中冷凍平衡10和30 min冷凍食蟹猴精子，比較了不同冷凍平衡時間對食蟹猴精子復蘇活力的影響。結(jié)果表明，采用SpermCryo作為冷凍液，液氮蒸汽平衡時間為10 min可獲得較高的食蟹猴精子凍存復蘇活力。研究表明，非人靈長類精子細胞膜對水的通透性在冰點以下時較在冰點以上時成百倍下降［23］。因此，食蟹猴精子在冷凍過程中脫水過程主要發(fā)生在冰點以前，延長冷凍平衡時間(30 min)并不能進一步使精子細胞脫水，反而可能使精子長期處于高濃度溶質(zhì)和高滲透壓的非正常生理環(huán)境導致食蟹猴冷凍精子的復蘇活力下降。該研究冷凍平衡時間與Li等［1］報道的液氮蒸汽冷凍平衡時間(10 min)相似，說明食蟹猴精子在冷凍保存時液氮蒸汽冷凍平衡10 min已經(jīng)脫水充分。

研究表明，不同的細胞類型和不同的冷凍液存在著數(shù)值各不相同的最佳冷凍速率。Mazur等針對細胞在冷凍時存在最佳冷凍降溫速率，提出了細胞冷凍損傷的“兩因素”假說［24］:如果降溫速率過快，精子還沒有充分脫水，水分已經(jīng)在胞內(nèi)形成胞內(nèi)冰晶，從而導致精子受到胞內(nèi)冰晶損傷(Intracellular ice formation damage);如果冷凍速率過慢，導致細胞外溶液溶質(zhì)濃度和滲透壓的過高，細胞長期處于這種非正常生理環(huán)境中而受到溶液損傷(Solution damage)。因此，精子在冷凍過程中使用最佳冷凍速率時，可獲得最高的精子冷凍保存復蘇活力。以前研究表明不同的冷凍降溫速率可以影響獼猴精子的冷凍復蘇存活率獼猴精子冷凍保存的適宜降溫速率為液氮面上方4 cm處及降溫速率－183℃/min［16］。然而，SpermCryo冷凍液的商品使用說明中并未推薦精子冷凍保存的最佳降溫速率。該研究采用3種不同的降溫速率1、4和7 cm(相應的降溫速率分別是 －435、－183和－69℃/min)冷凍食蟹猴的精子，比較了不同降溫速率對食蟹猴精子復蘇活力的影響。結(jié)果表明，雖然采用－435℃/min冷凍速率可以獲得最高的精子復蘇活力。但是，與采用－183℃/min冷凍速率獲得的精子復蘇率并沒有明顯差異。這與獼猴精子冷凍保存使用的最佳冷凍速率－183℃/min不同［16］。這可能是由于物種差異或者使用不同冷凍液和冷凍方法所致。另外，精子冷凍保存后，與精子活力相比，精子頂體的完整性受到冷凍速率和冷凍平衡時間的影響較小，表明精子的活力對于冷凍速率和冷凍平衡時間更為敏感。這與Li等［1］報道的用含卵黃的冷凍液保存的食蟹猴精子解凍復蘇后的頂體完整率的結(jié)果類似。

研究表明，不同類型的冷凍液保護劑對精子冷凍保存精子復蘇活力有明顯差異［4］。由于無卵黃冷凍液與卵黃冷凍液相比成分簡單，這對于食蟹猴精子冷凍保存中保護機制的研究十分重要。此外，由于卵黃潛在含有的傳染性病原體(病毒、細菌)可能增加衛(wèi)生安全的風險［9－10］。筆者通過采用無卵黃SpermCryo冷凍液冷凍保存食蟹猴精子獲得41.9%的精子冷凍保存復蘇率，達到Paras L報道采用SpermCryo冷凍液獲得人類精子冷凍保存精子復蘇率(32.3%)水平。此外，SpermCryo冷凍液的凍存方法簡單迅捷，經(jīng)過該試驗優(yōu)化后的整個精子冷凍過程只需要20 min，明顯比先前報道的精子冷凍過程時間(180 min)短［25］，操作步驟簡單。

筆者使用SpermCryo冷凍液冷凍保存食蟹猴精子，研究液氮蒸氣平衡時間和降溫速率對食蟹猴精子冷凍保存精子復蘇活力的影響方法，建立了SpermCryo無卵黃冷凍液冷凍保存食蟹猴精子的方法。食蟹猴精子冷凍保存中采用液氮蒸氣平衡10 min和距液氮面1和4 cm的降溫速率可獲得較高食蟹猴精子冷凍保存復蘇活力。與常規(guī)冷凍保存方法相比，采用SpermCryo這種商品化無卵黃冷凍液可以簡單快速完成食蟹猴精子的冷凍保存，對深入研究食蟹猴精子的冷凍損傷機制及其在輔助生殖中的應用具有重要意義。

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