新孢子蟲NcGRA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在293細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

金春梅，朱慧敏，于龍政，張守發(fā)(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133002)

新孢子蟲病(Neosporaosis)是由犬新孢子蟲(Neospora caninum)寄生于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)所引起的一種原蟲?。?］。犬新孢子蟲對(duì)懷孕母牛的危害尤為嚴(yán)重，可以引起流產(chǎn)，并且通過垂直傳播將蟲體垂直傳播給新生犢牛，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。致密顆粒蛋白是一種新孢子蟲排泄－分泌抗原，在刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)中起到重要作用。致密顆粒在蟲體感染宿主細(xì)胞后的前期大量分泌，是帶蟲空泡及包囊壁的重要組成成分。其中，NcGRA2是新孢子蟲速殖子表達(dá)量較大的一種致密顆粒蛋白，可以有效抵御新孢子蟲速殖子感染［3］。

目前，國(guó)內(nèi)外還沒有找到治療新孢子蟲病的特效藥，主要以預(yù)防為主，實(shí)行管理上的防疫措施只能在一定程度上減少新孢子蟲的感染，效果往往不顯著，關(guān)注較多的還是新孢子蟲疫苗的研究［4］?；诖耍P者利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因的特性，構(gòu)建新孢子蟲NcGRA2基因真核表達(dá)質(zhì)粒，以期將體外表達(dá)的蛋白作為免疫原，為進(jìn)一步研制新孢子蟲核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與載體 含有NcGRA2基因的質(zhì)粒pGEX-4T1-NcGRA2由實(shí)驗(yàn)室自制;真核表達(dá)載體pcDNA3.1購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞株與試劑 293細(xì)胞和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩Ｏ拗菩詢?nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ、DNA Marker、DNA連接酶、DNA純化回收試劑盒均為TaKa-Ra公司產(chǎn)品;新孢子蟲陽性血清由實(shí)驗(yàn)室制備并保存;Alexa 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自Molecular Probes公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒ViaFect Transfection Reagent為Promega公司產(chǎn)品。

1.3 NcGRA2基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建 pGEX-4T1-NcGRA2質(zhì)粒DNA與pcDNA3.1質(zhì)粒DNA分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收純化，然后用DNA連接酶進(jìn)行連接。

1.4 重組質(zhì)的酶切鑒定與序列測(cè)定 經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至英捷濰基公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞 將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)載體pcDNA3.1按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書中的操作步驟轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。

1.6 間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白的體外表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用－20℃預(yù)冷的甲醇固定10 min，加入一抗(感染新孢子蟲鼠血清1∶200倍稀釋)，37℃孵育2 h，PBS沖洗3次。加入二抗(Alexa 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體1∶4 000倍稀釋)，37℃下孵育1 h，PBS洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T1-NcGRA2質(zhì)粒的酶切結(jié)果 pGEX-4T1-NcGRA2質(zhì)粒DNA經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切得到2個(gè)片段，其中較小的1段在636 bp處(圖1)，這與預(yù)期結(jié)果相符合。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 NcGRA2酶切回收后與pcDNA3.1連接，挑了2個(gè)克隆株，用HindⅢ酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行切鑒定，其中1個(gè)克隆株是正確的，得到的279 bp的目的條帶片斷，與預(yù)期片斷相符。另外1個(gè)克隆株酶切片段與預(yù)期片段不符，屬于錯(cuò)誤連接。

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn) 鑒定為陽性重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，經(jīng)過甲醇固定、一抗和二抗的孵育，在熒光顯微鏡下，可見在細(xì)胞表面出現(xiàn)特異熒光(圖3A)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞無熒光(圖3B)。

3 討論

新孢子蟲病能感染多種動(dòng)物，對(duì)牛只威脅嚴(yán)重，主要引起母牛流產(chǎn)，目前缺乏有效預(yù)防新孢子蟲病的疫苗。新孢子蟲GRA2蛋白具有良好的抗原性［5］。真核表達(dá)載體pcDNA3.1包含有CMV高效啟動(dòng)子，是一種外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的良好載體，目前被廣泛應(yīng)用于DNA疫苗的構(gòu)建研究［6］。

筆者將新孢子蟲全長(zhǎng)GRA2基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，通過間接熒光抗體試驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)所構(gòu)建的pcDNA3.1-NcGRA2真核表達(dá)載體能在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白NcGRA2，可為進(jìn)一步研究抗新孢子蟲病的核酸疫苗提供基礎(chǔ)。

［1］DUBERY J P，CARPENTER J L，SPEER C A，et al.Newly recognize falal protozoan disease of dogs［J］.J Am Vet Med Assoc，1988，192(9):1269-1285.

［2］丁德，于龍政，張守發(fā)，等.吉林省部分地區(qū)黃牛新孢子蟲病的流行病學(xué)調(diào)查［J］.畜牧與獸醫(yī)，2006，38(11):34-36.

［3］劉群.新孢子蟲?。跰］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2012:85.

［4］張寧，趙博偉，胡曉悅，等.牛新孢子蟲病最新研究進(jìn)展［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012，13(1):10-13.

［5］STROHBUSCH M，MüLLER N，HEMPHILL A，et al.NcGRA2 as a molecular target to assess the parasiticidal activity of toltrazuril against Neospora caninum［J］.Parasitology，2008，135:1065-1073.

［6］茆達(dá)干，楊利國(guó)，曹少先.影響基因疫苗免疫效果的因素［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2004，20(5):360-366.