陳臻毅，侯學(xué)文，蘇志堅(jiān)，邱道壽(1．廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640;．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510640;．暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 5106)

蚓激酶是具纖溶或溶栓活性的多酶組分，又稱蚯蚓纖溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzymes，EFE)，是一類含多組分的纖維蛋白水解酶，廣泛分布于多種蚯蚓的消化道內(nèi)腔及體液中［1－2］。蚓激酶可以直接和間接水解纖維蛋白，具有溶解血栓和阻止血栓形成的功效;還可以將纖溶酶原激活并轉(zhuǎn)化為纖溶酶，或刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織纖溶酶原激活劑(t-PA)，從而能夠間接溶解血栓［3］。鑒于蚓激酶具有這些功效作用，且副作用極小，因此被認(rèn)作是一種比尿激酶、鏈激酶、t-PA等應(yīng)用前景更好的溶栓藥物。目前臨床應(yīng)用的蚓激酶都是從蚯蚓體內(nèi)直接提取的，不僅制備工藝復(fù)雜，而且產(chǎn)量較低。近年來，利用基因工程手段重組表達(dá)蚓激酶成為當(dāng)前熱點(diǎn)，國內(nèi)外已有許多專家試圖通過基因工程技術(shù)將蚓激酶基因?qū)氪竽c桿菌［4］、酵母菌［5］、桿狀病毒［6］、牛乳腺細(xì)胞［7］、山羊乳腺細(xì)胞［8］和植物［9－11］等，以期重組表達(dá)蚓激酶蛋白。筆者以經(jīng)過植物密碼子優(yōu)化后的蚓激酶成熟肽F-III-1為目的基因，通過構(gòu)建植物表達(dá)載體，為利用基因工程方法在植物中表達(dá)蚓激酶蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 pCAMBIA3301載體、宿主菌E．coli TOP10為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;pBA002載體為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)解新明教授惠贈(zèng);蚓激酶基因的原始序列來自GenBank數(shù)據(jù)庫的蚓激酶成熟肽F-III-1(AAA96503．1)，在保持其氨基酸序列不變的前提下，利用中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因島網(wǎng)站(http://life．sysu．edu．cn/genedao/genetown/service/DNA_synthesis_empty．php3)進(jìn)行了煙草(Nicotiana tabacum)密碼子偏好性優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化后的基因序列設(shè)計(jì)合成13條超長引物，通過重疊延伸PCR(overlap extension PCR)方法完成片段的合成;Ex Taq DNA聚合酶、KOD高保真酶、連接試劑盒購自大連寶生物技術(shù)公司;質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒購自O(shè)MRGA公司;核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)購自上海生工生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶購自Biolabs公司;其他試劑均由國內(nèi)相關(guān)廠家及公司生產(chǎn);PCR引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成;DNA測序由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

1．2 目的基因的亞克隆改造

1．2．1 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)植物表達(dá)載體 pCAMBIA3301和pBA002多克隆位點(diǎn)的特性，以上述優(yōu)化后的F-III-1基因序列為模板，設(shè)計(jì)5條PCR引物(表1)，通過PCR反應(yīng)對(duì)F-III-1基因進(jìn)行亞克隆改造。

表1 引物序列及酶切位點(diǎn)

1．2．2 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系:反應(yīng)總體積為 50 μl，其中上、下游引物各 2．5 μl，10 × KOD-Plus Neo buffer 5 μl，25 mmol/L MgSO43 μl，2．0 mmol/L dNTP 5 μl，F(xiàn)-III-1 基因片斷(200 ng/μl)1 μl，KOD-Plus Neo 1 μl，用無菌雙蒸水補(bǔ)齊至50 μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;98℃變性10 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min，共28次循環(huán);最后68℃延伸5 min，4℃保持。

1．2．3 F-III-1基因酶切位點(diǎn)的改造與His-tag的引入。根據(jù)上述PCR反應(yīng)程序，以F-III-1基因?yàn)槟０澹肗LK-NcoI-1-F和NLK-PmlI-R作為上、下游引物，通過PCR擴(kuò)增在F-III-1基因首尾引入NcoI、PmlI雙酶切位點(diǎn);以同樣的方法，用NLK-XhoI-1-F、pMD18-T-BamHI-R為上、下游引物，通過PCR擴(kuò)增在F-III-1基因首尾引入XhoI、BamHI雙酶切位點(diǎn);以NLK-NcoI-1-F、NLK-PmlI-717-R(His6)為上、下游引物，在 FIII-1基因末尾引入6xHis-tag，首尾引入NcoI、PmlI雙酶切位點(diǎn);以F-III-1(6xHis)基因?yàn)槟０?，用NLK-XhoI-1-F、pMD18-T-BamHI-R作為上、下游引物，在F-III-1(6xHis)基因首尾引入XhoI、BamHI雙酶切位點(diǎn)(圖1)。

1．2．4 PCR產(chǎn)物與pMD18-T-S載體的連接和測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、純化，用rTaq酶給目的片段加A尾巴，rTaq 的 10 μl反應(yīng)體系:純化的目的片段 8．5 μl，10 ×rTaq buffer 1 μl，rTaq 0．2 μl，用無菌雙蒸水補(bǔ)足至 10 μl。然后用T4DNA連接酶與pMD18載體4℃連接過夜。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，以菌落為模板，以pMD18載體通用引物進(jìn)行PCR篩選陽性克隆。選取若干PCR呈陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和生物有限公司測序，將測序驗(yàn)證正確的菌株于15%甘油中－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 用NcoI、PmlI雙酶切pMD18-F-III-1重組質(zhì)粒，試劑盒回收小片段，同時(shí)用NcoI、PmlI雙酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒，試劑盒回收大片段?；厥蘸蟮拇?、小片段用試劑盒進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E．coli Top10感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株。提取陽性轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和生物有限公司測序驗(yàn)證。用同樣方法NcoI、PmlI雙酶切pMD18-F-III-1-6xHis)重組質(zhì)粒，回收小片段，NcoI、PmlI雙酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒，回收大片段，大、小片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10，涂布Kan抗性LB平板，篩選陽性菌株，PCR和酶切鑒定，測序驗(yàn)證。

按照上述相同的方法，用XhoI與BamHI分別雙酶切pMD18-F-III-1與pMD18-F-III-1-6xHis重組質(zhì)粒，試劑盒回收小片段，同時(shí)用NcoI、PmlI雙酶切pBA002質(zhì)粒，試劑盒回收大片段?；厥蘸蟮拇?、小片段分別用試劑盒進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E．coli Top10感受態(tài)細(xì)菌，涂布含Spe(壯觀霉素)抗性的LB平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)、篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株。提取陽性轉(zhuǎn)化菌株質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和生物有限公司測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2．1 F-III-1基因的亞克隆 以煙草密碼子偏好性優(yōu)化后的F-III-1基因片段為模板，分別用NLK-NcoI-1-F和NLK-PmlIR、NLK-XhoI-1-F 和 pMD18-T-BamHI-R、NLK-NcoI-1-F 和NLK-PmlI-717-R(His6)等作為上、下游引物，通過高保真酶PCR擴(kuò)增，在F-III-1基因首尾分別引入NcoI和PmlI、XhoI和BamHI、XhoI和BamHI等雙酶切位點(diǎn)以及基因末尾引入6xHis-tag等亞克隆操作。首尾進(jìn)行了雙酶切位點(diǎn)改造的FIII-1基因(圖2a)和末尾引入6xHis-tag的F-III-1基因(圖2b)，其PCR擴(kuò)增得到750 bp左右的單一條帶，與預(yù)計(jì)片段717 bp和735 bp大小相近，經(jīng)測序驗(yàn)證分別為所需目的片段(圖2)。

2．2 表達(dá)載體的構(gòu)建 用NcoI、PmlI雙酶切pMD18-F-III-1重組質(zhì)粒，1%瓊脂糖電泳酶切產(chǎn)物，結(jié)果見圖3。由圖3可知，電泳圖中可見2條帶，一條為750 bp左右，應(yīng)為目的片段F-III-1;另一條為2 700 bp左右，應(yīng)為pMD18的骨架鏈(圖3a)。同樣，以NcoI、PmlI雙酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒，電泳圖中也可見2條帶，一條為2 000 bp左右，應(yīng)為GUS片段，另一條為9 000 bp左右，應(yīng)是pCAMBIA3301的骨架鏈(圖3b)。試劑盒回收750 bp左右的目的小片段和2 700 bp左右的pCAMBIA3301骨架大片段?；厥蘸蟮拇蟆⑿∑瓮ㄟ^連接、轉(zhuǎn)化和抗性篩選，獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-F-III-1陽性轉(zhuǎn)化菌株。同法，獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-F-III-1-6xHis陽性轉(zhuǎn)化菌株。

用NcoI、PmlI雙酶切重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-F-III-1與pCAMBIA3301-F-III-1-6xHis，瓊脂糖電泳酶切產(chǎn)物，分別可見2條電泳條帶，一條為750 bp左右，分別為F-III-1與F-III-1-6xHis片段，另一條為9 200 bp左右，為pCAMBIA3301載體骨架(圖4)。兩陽性重組載體再送專業(yè)公司測序，得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。

用XhoI與BamHI分別雙酶切pMD18-F-III-1與pMD18-F-III-1-6xHis重組質(zhì)粒，回收小片段，同時(shí)用NcoI、PmlI雙酶切pBA002質(zhì)粒，回收大片段?；厥蘸蟮拇?、小片段分別進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、抗性篩選，分別獲得重組質(zhì)粒pBA002-F-III-1與pBA002-F-III-1-6xHis陽性轉(zhuǎn)化菌株。將構(gòu)建好的pBA002-F-III-1、pBA002-F-III-1-6xHis 表達(dá)載體分別用 XhoI、BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，可見2條條帶，一條為750 bp左右，應(yīng)為F-III-1或F-III-1-6xHis片段，另一條為10 000 bp，應(yīng)為pBA002載體骨架(圖5)。

將上述4個(gè)陽性重組載體送專業(yè)公司測序，進(jìn)一步證實(shí)4個(gè)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-F-III-1、pCAMBIA3301-FIII-1-6xHis、pBA002-F-III-1 和 pBA002-F-III-1-6xHis得到成功構(gòu)建，其構(gòu)建流程圖見圖6。

3 小結(jié)與討論

將外源目的基因有效導(dǎo)入植物基因組是植物分子生物學(xué)和遺傳工程的一項(xiàng)基本技術(shù)［12］，目的基因的轉(zhuǎn)化首先必須構(gòu)建含有目的基因的植物表達(dá)載體，植物表達(dá)載體的構(gòu)建是一個(gè)較復(fù)雜的過程，涉及到質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等過程［13］。構(gòu)建表達(dá)載體一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟是目的基因的亞克隆，通過設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增來改變目的基因兩端的酶切位點(diǎn)是通常要應(yīng)用的操作，在此過程中需要考慮到表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基和起始密碼子等，確保編碼蛋白不會(huì)出現(xiàn)移碼等問題。在目的片段和表達(dá)載體連接過程中，如果引物自身已足夠長還要添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基時(shí)，可以考慮引入T-載體，T-載體可以將Taq，Tth，AmpliTaq直接相連。筆者在構(gòu)建pCAMBIA3301-F-III-1-6xHis表達(dá)載體時(shí)，綜合考慮到引物的特點(diǎn)，引入了T-載體，結(jié)果表明克隆效率非常高。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)日趨完善，利用轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白正成為當(dāng)前該領(lǐng)域中研究最活躍、產(chǎn)業(yè)發(fā)展最迅速、效益最顯著的熱點(diǎn)之一。與微生物和動(dòng)物生物反應(yīng)器相比較，植物生物反應(yīng)器具有生產(chǎn)成本低、遺傳轉(zhuǎn)化簡單、后代遺傳性狀穩(wěn)定、無毒副作用、安全性好、表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行正確修飾［14］等優(yōu)勢。因此，植物生物反應(yīng)器被廣泛使用于細(xì)胞素、激素、營養(yǎng)蛋白、單克隆抗體、酶、疫苗、各種生長因子及其他一些藥物的原料生產(chǎn)［15］。煙草作為一種轉(zhuǎn)基因模式植物，易于遺傳轉(zhuǎn)化獲得穩(wěn)定性狀的轉(zhuǎn)化植株，且種植面積大。自基因工程技術(shù)產(chǎn)生以來，利用煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究成果很多，這是煙草得天獨(dú)厚之處［16］。目前，人們對(duì)于煙草的遺傳性狀、外源基因的導(dǎo)入、基因整合和表達(dá)、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)、植株再生和優(yōu)良株系選育等已經(jīng)形成了較成熟的技術(shù)流程［17］。因此，該研究構(gòu)建的4個(gè)植物表達(dá)載體為探討蚓激酶在植物中的高效表達(dá)提供了技術(shù)平臺(tái)。

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