超聲波輔助復(fù)合酶提取雞軟骨中硫酸軟骨素

宋志鵬，徐麗萍，王　鑫(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

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超聲波輔助復(fù)合酶提取雞軟骨中硫酸軟骨素

宋志鵬，徐麗萍，王鑫(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

摘要：以雞軟骨為原料，采用超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素，以硫酸軟骨素得率為考察指標(biāo)，選取最優(yōu)提取方法，并對最優(yōu)方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面優(yōu)化.試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為超聲波功率500 W，超聲時(shí)間120 min，堿性蛋白酶添加量為1%，木瓜蛋白酶添加量為2%，硫酸軟骨素得率可達(dá)到36.08%.超聲波輔助堿-雙酶法耗時(shí)短，操作簡單且得到的產(chǎn)品純度高.

關(guān)鍵詞：雞軟骨；硫酸軟骨素；雙酶；超聲波

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)又稱牛磺軟骨素、康得寧，多分布于哺乳動物的軟骨、肌膜和韌帶中，是結(jié)締組織的主要成分之一[1].硫酸軟骨素一種白色或淡黃色的粉末，無臭、無味，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，易溶于水.低溫條件下比較穩(wěn)定，當(dāng)溫度在60℃以上時(shí)則會降解[2].硫酸軟骨素具有抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗感染、增強(qiáng)免疫功能、清除自由基以及抗腫瘤等生理功能[3-5].在不同動物體內(nèi)的存在類型不同，在豬、牛、羊等動物的軟骨中主要存在的是硫酸軟骨素A，而在鯊魚等海洋動物體內(nèi)主要含有的是硫酸軟骨素C[6]軟骨中的硫酸軟骨素以蛋白多糖的形式存在，是一種酸性粘多糖[7].

硫酸軟骨素對于角膜炎、視力老化等眼科疾病具有一定的治療效果，可與生理鹽水、羥基水楊酸己基汞鈉等藥物制成復(fù)方眼藥水[8-11].硫酸軟骨素在作為臨床生化藥物的同時(shí)，還被人們用在膳食補(bǔ)充劑中來改善人體機(jī)能[12-13].動物軟骨中的硫酸軟骨素迄今為止仍無法人工合成[14]，因而其提取及應(yīng)用已成為當(dāng)前功能性食品研究的一大熱點(diǎn).本文采用超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素，找出一種簡單合理、成本低廉的提取硫酸軟骨素的方法，使之能夠盡快應(yīng)用于生產(chǎn)當(dāng)中，同時(shí)提高農(nóng)產(chǎn)品附加值，對發(fā)展我國經(jīng)濟(jì)具有十分深遠(yuǎn)的意義.

1材料與方法

1.1材料與儀器

雞軟骨，哈爾濱千鶴冷凍食品；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，天津市大陸化學(xué)試劑廠；氯化鈉，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；鹽酸、濃硫酸，西隴化工股份有限公司；咔唑，上海源葉生物科技有限公司.

FZ102型中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；DL-5-B型低速容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ZDF-6090型真空干燥箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；ALC-1100.2型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；酒精計(jì)，河間市黎民居玻璃儀表廠；KQ-500VDE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1雞軟骨預(yù)處理

雞軟骨經(jīng)解凍處理后，置于鍋內(nèi)煮約30 min，至雞軟骨表面附著肉、筋膜、脂肪及其他軟組織等雜質(zhì)脫落，清水洗凈，切割至薄片，烘干，粉碎，過40目篩后備用.

1.2.2硫酸軟骨素的提取

取5 g軟骨粉，按料液比1∶20(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為3%的NaOH溶液，置于500 W、25 ℃條件下超聲波輔助提取120 min.調(diào)節(jié)pH至10，加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的堿性蛋白酶[15-16]，50 ℃條件下攪拌酶解3 h.將酶解液進(jìn)行離心操作，取上清液.調(diào)節(jié)pH值至6.8，加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解.55 ℃水浴加熱0.5 h后，80 ℃恒溫5 min滅酶.離心，取上清液.將上清液調(diào)至中性，按濾液體積加入 2%的NaCl，攪拌至溶解加入無水乙醇至醇沉體系體積分?jǐn)?shù)為 65%(V/V)，靜置過夜，收集沉淀離心，離心得到的沉淀再用少量無水乙醇洗滌脫水，放于鼓風(fēng)干燥箱 60 ℃干燥，得到硫酸軟骨素粗提物.

1.2.3硫酸軟骨素含量測定

準(zhǔn)確稱取0.01 mL硫酸軟骨素樣品置于25mL具塞試管中，加入蒸餾水稀釋至 5 mL，冰水浴中冷卻.加入6 mL濃硫酸，蓋塞振蕩均勻后置于沸水中加熱 20 min，取出放于冰水浴中冷卻.加入 0.20 mL咔唑溶液，搖勻后置于沸水中加熱 15 min，顯色，取出迅速置于冰水浴中冷卻至室溫.用無醛乙醇作為空白溶液進(jìn)行參比，在 526 nm波長下測定硫酸軟骨素溶液的吸光度值.

1)硫酸軟骨素含量的計(jì)算

其中：C為測量質(zhì)量濃度，mg/mL； n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積；mL； M為原料干重，g.

2)硫酸軟骨素得率的計(jì)算

其中：W為硫酸軟骨素得率，% ；m為硫酸軟骨素粗品質(zhì)量，g ；M為干燥雞軟骨粉質(zhì)量，g.

3)硫酸軟骨素純度的計(jì)算

其中：W為硫酸軟骨素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，% CS為硫酸軟骨素百分含量，% ； P為硫酸軟骨素得率，%.

1.2.4硫酸軟骨素提取工藝單因素試驗(yàn)

1) 超聲波時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

稱取5份3g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為3%的NaOH溶液，置于500W、25 ℃條件下超聲波輔助提取100、120、140、160、180min.之后按提取方法的工藝流程進(jìn)行操作，得到硫酸軟骨素粗提物.干燥稱重，計(jì)算硫酸軟骨素得率.

2) 超聲波功率單因素實(shí)驗(yàn)

稱取5份3g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為3%的NaOH溶液，置于300、350、400、450、500W，25 ℃條件下超聲波輔助提取120min.之后按1.2.2進(jìn)行試驗(yàn).干燥稱重，計(jì)算硫酸軟骨素得率.

3)堿性蛋白酶添加量單因素實(shí)驗(yàn)

稱取5份3g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為3%的NaOH溶液，置于500W、25 ℃條件下超聲波輔助提取120min.調(diào)節(jié)pH至10，加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的堿性蛋白酶，50 ℃條件下攪拌酶解3h.離心，取上清液.之后按1.2.2進(jìn)行試驗(yàn).干燥稱重，計(jì)算硫酸軟骨素得率.

4)木瓜蛋白酶添加量單因素實(shí)驗(yàn)

稱取5份3g原料，按料液比1∶20(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)為3%的NaOH溶液，置于500W，25 ℃條件下超聲波輔助提取120min.調(diào)節(jié)pH至10，加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的堿性蛋白酶，50 ℃條件下攪拌酶解3h.離心，取上清液.調(diào)節(jié)pH值至6.8，加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%的木瓜蛋白酶酶解.55 ℃水浴加熱0.5h后，80 ℃恒溫5min滅酶.離心，取上清液.將上清液調(diào)至中性，按濾液體積加入2%的NaCl.醇沉，干燥，得到硫酸軟骨素粗提物.稱重，計(jì)算硫酸軟骨素得率.

1.2.5響應(yīng)曲面法優(yōu)化硫酸軟骨素的提取工藝條件

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken模型對超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素的工藝條件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化.以硫酸軟骨素得率為響應(yīng)值，考察超聲波時(shí)間、堿性蛋白酶添加量、木瓜蛋白酶添加量三個(gè)因素對硫酸軟骨素得率的影響.各因素的區(qū)間為：超聲波時(shí)間100～120min，堿性蛋白酶添加量0.8%～1.2%，木瓜蛋白酶添加量1.8%～2.2%，因子編碼及水平見表1.

表1　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

2結(jié)果與討論

2.1硫酸軟骨素提取結(jié)果

采用超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素，經(jīng)濃縮干燥，三次平行試驗(yàn)得率分別為30.07%、34.37%、31.25%，平均得率為31.89%.

2.2硫酸軟骨素提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1超聲波時(shí)間實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

由圖1可以看出，超聲時(shí)間在100～120 min范圍內(nèi)時(shí)，硫酸軟骨素得率隨著時(shí)間的延長而增加，在時(shí)間為120 min時(shí)達(dá)到最大值為30.44%.這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長，超聲波的空化和機(jī)械震蕩等作用得到充分發(fā)揮，可使細(xì)胞破裂更完全，使硫酸軟骨素得率隨之增大.但時(shí)間超過120 min后，硫酸軟骨素得率反而隨著超聲時(shí)間的延長而降低，這可能是由于長時(shí)間的作用造成了大分子多糖的斷裂，其中部分硫酸軟骨素發(fā)生水解，而且水解程度大于浸出的速度，造成提取過程中的損失增大而使硫酸軟骨素得率降低.結(jié)果分析可知，最佳超聲時(shí)間為120 min.

圖1　超聲時(shí)間對硫酸軟骨素得率的影響

2.2.2超聲波功率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

由圖2可以看出，超聲波功率在350～500 W范圍內(nèi)時(shí)，硫酸軟骨素的得率隨著功率的增加而增加，在功率500 W時(shí)達(dá)到最大值為30.25%.這是因?yàn)殡S著超聲波功率的增加，超聲波的空化和機(jī)械震蕩等作用得到充分發(fā)揮，可使細(xì)胞破裂更完全，使硫酸軟骨素得率隨之增大，在500 W時(shí)達(dá)到最大值.結(jié)果分析可得，最佳超聲波功率為 500 W.

圖2　超聲波功率對硫酸軟骨素得率的影響

2.2.3堿性蛋白酶添加量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

見圖3.

圖3　堿性蛋白酶添加量對硫酸軟骨素得率的影響

2.2.4木瓜蛋白酶添加量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

由圖3可以看出，當(dāng)堿性蛋白酶添加量在0.6～1.0%的范圍內(nèi)時(shí)，隨著酶添加量的增加，硫酸軟骨素的得率也隨之增加，在1.0%時(shí)達(dá)到最大值30.37%.酶添加量超過1.0%后，硫酸軟骨素得率隨添加量的增加而逐漸降低.這可能是因?yàn)樵诿笣舛容^低時(shí)，底物不能與酶充分反應(yīng)，從而限制了蛋白質(zhì)的水解程度，但隨著酶添加量的不斷加大，所有的底物都能與酶進(jìn)行充分反應(yīng)，以蛋白多糖形式存在的硫酸軟骨素可以得到充分釋放，進(jìn)而提高了硫酸軟骨素的得率.但如果酶添加量繼續(xù)不斷增大，會造成酶作為一種未被水解的蛋白質(zhì)殘留在提取液中的現(xiàn)象，進(jìn)而降低了硫酸軟骨素的得率.結(jié)果分析可得，1.0%為最佳堿性蛋白酶添加量.

由圖4可以看出，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量在1.6%～2.0%的范圍內(nèi)時(shí)，隨著酶添加量的增加，硫酸軟骨素的得率也隨之增加，在2.0%時(shí)達(dá)到最大值32.57%.酶添加量超過2.0%后，硫酸軟骨素得率隨添加量的增加而逐漸降低.這可能是因?yàn)樵诿笣舛容^低時(shí)，底物不能與酶充分反應(yīng)，從而限制了蛋白質(zhì)的水解程度，但隨著酶添加量的不斷加大，所有的底物都能與酶進(jìn)行充分反應(yīng)，以蛋白多糖形式存在的硫酸軟骨素可以得到充分釋放，進(jìn)而提高了硫酸軟骨素的得率.但如果酶添加量繼續(xù)不斷增大，會造成酶作為一種未被水解的蛋白質(zhì)殘留在提取液中的現(xiàn)象，進(jìn)而降低了硫酸軟骨素的得率.結(jié)果分析可得，2.0%為最佳木瓜蛋白酶添加量.

圖4　木瓜蛋白酶添加量對硫酸軟骨素得率的影響

2.3響應(yīng)曲面法優(yōu)化硫酸軟骨素提取工藝條件實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

見表2.

2.3.1超聲時(shí)間與堿性蛋白酶添加量的交互作用的分析與優(yōu)化

圖5反映了超聲時(shí)間和堿性蛋白酶添加量的交互作用對硫酸軟骨素得率的影響.從超聲時(shí)間與堿性蛋白酶添加量的等高線和響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為2%時(shí)，這兩個(gè)因素的交互作用比較顯著.在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，超聲時(shí)間和堿性蛋白酶添加量分別在110～120 min和1.0～1.1%的范圍內(nèi)，硫酸軟骨素得率達(dá)到最大值.

表2　響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

圖5　超聲時(shí)間、堿性蛋白酶添加量及其交互作用對硫酸軟骨素得率影響的等高線圖和響應(yīng)圖

2.3.2超聲時(shí)間與木瓜蛋白酶添加量的交互作用的分析與優(yōu)化

圖6反映了超聲時(shí)間和木瓜蛋白酶添加量的交互作用對硫酸軟骨素得率的影響.從超聲時(shí)間與木瓜蛋白酶添加量的等高線和響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)堿性蛋白酶添加量為1%時(shí)，這兩個(gè)因素的交互作用顯著.在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，超聲時(shí)間和木瓜蛋白酶添加量分別在110～120 min和2.0%～2.1%的范圍內(nèi)，硫酸軟骨素得率達(dá)到最大值.

圖6　超聲時(shí)間、木瓜蛋白酶添加量及其交互作用對硫酸軟骨素得率影響的等高線圖和響應(yīng)圖

2.3.3堿性蛋白酶添加量與木瓜蛋白酶添加量的交互作用的分析與優(yōu)化

圖7反映了堿性蛋白酶添加量和木瓜蛋白酶添加量的交互作用對硫酸軟骨素得率的影響.從堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶添加量的等高線和響應(yīng)曲面可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間為120 min時(shí)，這兩個(gè)因素的交互作用顯著.在實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶添加量分別在1.0%～1.1%和2.0%～2.1%的范圍內(nèi)，硫酸軟骨素得率達(dá)到最大值.

圖7　堿性蛋白酶添加量、木瓜蛋白酶添加量及其交互作用對硫酸軟骨素得率影響的等高線圖和響應(yīng)圖

2.3.4方差分析及顯著性檢驗(yàn)

表3　響應(yīng)面模型方差分析表

利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素的超聲時(shí)間(X1)、堿性蛋白酶添加量(X2)和木瓜蛋白酶添加量(X3)的二次多元回歸方程為：

Y=27.63-0.37X1+1.12X2-0.57X3+0.15X1X2+0.15X1X3-0.85X2X3-2.20X12-1.71X22-6.67X32

表4　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

從表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，模型一次項(xiàng)X2顯著，二次項(xiàng)均顯著.最佳工藝條件：超聲時(shí)間120.61min、堿性蛋白酶添加量1.01%、木瓜蛋白酶添加量2.03%，硫酸軟骨素得率理論值為36.24%.

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的工藝條件，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件優(yōu)化工藝條件為：超聲時(shí)間120.00min、堿性蛋白酶添加量1.00%、木瓜蛋白酶添加量2.00%，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，硫酸軟骨素得率為36.24%，提取后硫酸軟骨素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.25%.

3結(jié)語

以雞軟骨為原料，采用超聲波輔助堿-雙酶法提取硫酸軟骨素，以硫酸軟骨素得率為參考指標(biāo)，對最佳提取方法的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化.確定最佳提取工藝為：超聲時(shí)間120min、堿性蛋白酶添加量1%、木瓜蛋白酶添加量2%，硫酸軟骨素得率為36.08%，提取后硫酸軟骨素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.25%.此方法成本低，耗時(shí)短，操作簡單，而且對環(huán)境污染小，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).

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Compound enzyme assisted ultrasonic extraction of chondroitin sulfate from chicken cartilages

SONG Zhi-peng, XU Li-ping, WANG Xin

(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract：Chondroitin sulfate was extracted by ultrasonic assisted compound enzyme with chicken cartilage as raw materials. The best extraction method was selected with chondroitin sulfate extraction yield as the examining index. The results showed that the optimum technological parameters were ultrasonic power of 500 W, ultrasonic time of 120 min, adding 1% alkaline protease, 2% papain, and the yield of CS could reach up to 36.08%. The method of ultrasonic assisted compound enzyme takes short time, and has the merit of simple operation and high purity product.

Key words：chicken cartilages; chondroitin sulfate; compound enzyme; ultrasonic

中圖分類號：TS251

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-0946(2016)01-0038-06

通訊作者：王鑫(1984-)，女，博士，講師，研究方向：食品化學(xué)，食品營養(yǎng)與安全.

作者簡介：宋志鵬(1995-)，男，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏.

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳項(xiàng)目(12541194)

收稿日期：2015-09-20.