任冬雪 成剛 李濤 王茜 路一平 趙海南(.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院,
河北 廊坊 065001;2.北京燕山玉龍石化工程有限公司, 北京 102500)
白芍為茅根科多年生草本芍藥的干燥根。味苦酸,性涼;入肝、脾經(jīng),對胸腹脅肋疼痛,瀉痢腹痛,自汗盜汗,陰虛發(fā)熱,月經(jīng)不調(diào)等癥有較好治療效果[1]。白芍的主要成分是芍藥苷,然而芍藥苷的藥用開發(fā)目前還有很多工作要做,如改進(jìn)分離、提取工藝,以獲得更多的有效成分。本試驗通過改變芍藥苷前處理方法,簡化實驗步驟,并通過改變洗脫溶劑,盡可能多的除去雜質(zhì),以減小試驗系統(tǒng)誤差、增加實驗的準(zhǔn)確度、同樣使樣品得到更好的分離,并延長色譜柱使用壽命,為白芍提取物的含量測定提供簡便可行的方法。
超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography/UPLC)是分離科學(xué)中的一個全新類別,其原理與高效液相色譜法基本相同。UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理論及原理,涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù),增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。目前,超高效液相色譜儀已經(jīng)開始逐漸地投入液相實驗中。主要應(yīng)用于藥物分析(如天然產(chǎn)物中復(fù)雜組分的分析)[2]、生化分析(如蛋白質(zhì)、多肽、代謝組學(xué)等生化樣品)、食品分析(如食品中農(nóng)藥殘留的檢測)[3]和環(huán)境分析(如水中微囊藻毒素的檢測)[4],此外,還用于化妝品中違禁品的檢測。
超高效液相色譜儀尤其對中藥研究領(lǐng)域的發(fā)展是一個極大的促進(jìn)。中藥的組分復(fù)雜,分離困難等問題都可以通過超高效液相色譜法逐漸解決。
實驗儀器:萬分之一電子天平;超高效液相色譜儀;Waters UPLC ;Waters T3。
實驗藥品:芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供);甲醇(分析純);甲醇(色譜純)。
(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗
實驗是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱;以甲醇-異丙醇-檸檬酸水溶液(5mol/L)(18∶2∶80)為流動相;檢測波長240nm;理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于4000。配制流動相用甲醇及異丙醇采用色譜純,其余試藥及溶劑采用分析純。
(2)對照品溶液的制備
精密稱定芍藥苷對照品10mg,置50ml容量瓶中,加80%甲醇溶解,定容,搖勻,精密量取5ml于50ml的容量瓶中,加80%甲醇制成每1ml含芍藥苷20μg的溶液,搖勻即得。
(3)供試品溶液的制備
取本品 0.08g(天平:萬分之一),精密稱定于25ml容量瓶中,加入80%甲醇適量,超聲處理使充分溶散,用80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密吸取2ml至25ml量瓶中,加80%甲醇稀釋至刻度,搖勻,過0.22um濾膜,即得。
(4)測定法
精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μL,依次注入超高效液相色譜儀,測定,根據(jù)色譜圖的積分值按公式進(jìn)行計算,即得。
以峰面積為縱坐標(biāo),以對照品進(jìn)樣濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程相關(guān)系數(shù)r,r≥0.999。
取同一批號樣品,平行制備6份供試品溶液,并按其色譜條件進(jìn)行測定,計算6份樣品測定結(jié)果的RSD值。經(jīng)測定白芍提取物中芍藥苷的平均含量為75.4mg/g,RSD%=0.61%,重復(fù)性良好。
制備對照品溶液,進(jìn)行對照品溶液穩(wěn)定性實驗。分別在0、2、4、8、16、24小時進(jìn)樣測定,計算峰面積的RSD 值。經(jīng)計算芍藥苷對照品溶液在24小時內(nèi)進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1.8%,24小時內(nèi)穩(wěn)定。
供試品溶液穩(wěn)定性實驗方法同上,經(jīng)計算芍藥苷供試品溶液在24小時內(nèi)進(jìn)樣峰面積的RSD分別為1.2%,24小時內(nèi)穩(wěn)定。
采用加入50%量的對照品,以同一批6份樣品測定結(jié)果進(jìn)行評價。
取同一批白芍浸膏約0.04g,精密稱定,再分別精密加入濃度為32.02mg/ml的對照品溶液10ml,相當(dāng)于加入芍藥苷對照品3.202mg。按照供試品制備方法制備供試品溶液,并進(jìn)行測定。結(jié)果如下表1。
表1 芍藥苷加樣回收率結(jié)果
結(jié)論:平均回收率為98.2%,RSD為1.4%,準(zhǔn)確度良好。
按照上述實驗方法和條件,分別用2種色譜柱(色譜柱①Waters T3;色譜柱② Waters BEHC18)對一批樣品芍藥苷含量進(jìn)行測定,觀察不同色譜柱對含量測定的影響。經(jīng)觀察兩種色譜柱測得芍藥苷含量的相對平均偏差為0.53%,耐用性良好。
取3批樣品,按同樣方法及色譜條件進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示樣品測定中兩份平行相對樣品的相對平均偏差均小于2.0,耐用性良好。
表2 耐用性樣品測定結(jié)果
本文通過超高效液相色譜法對白芍浸膏芍藥苷含量測定方法進(jìn)行驗證,包括線性與范圍、精密度、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性(即回收率)、耐用性及樣品含量測定。實驗結(jié)果顯示利用UPLC方法測定芍藥苷的含量有很多優(yōu)點,如可以提高實驗效率,簡化實驗步驟,減小實驗系統(tǒng)誤差、增加實驗的準(zhǔn)確度,使樣品得到更好的分離,提高分離度,為白芍提取物含量測定提供了簡便可行的方法。
[1]黃兆勝,中藥學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社,2011,452.
[2]王蕓.復(fù)雜天然產(chǎn)物特征組分HPLC篩選方法的研究[M].華東理工大學(xué),2011.
[3]Chen L.G.,Lan D.,Jin H.Y.et al.The determination of organochlorine pesticides based on dymanic microwave-assisted extraction coupled with on-line solid-phase extraction of highperformance liquid chromatography[J].Analytic Chimica Acta,2007,589:239-246.
[4]張立將,尹立紅,等.水中微囊藻毒素高效液相色譜檢測與前處理條件優(yōu)化[J].東南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,3:446-451.