李思銳，孫 陽，羅孝勇，郭向榮

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，中國長沙 410081)

惡性腫瘤是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類生命的重大疾病之一，轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤致死的最主要原因.大多數(shù)癌癥患者在確診時(shí)，腫瘤細(xì)胞已啟動(dòng)轉(zhuǎn)移級聯(lián)中的一個(gè)或多個(gè)步驟.惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是指從原發(fā)部位浸潤性生長、穿透細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入脈管(淋巴管或血管)、滲出脈管、在轉(zhuǎn)移部位生長、增殖［1-2］.各種細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞，其轉(zhuǎn)移機(jī)制是大體相同的，有很大的相似性和保守性，均為一個(gè)相互依存的多步驟循環(huán)過程［3-4］:A.細(xì)胞在趨化因子的刺激下，形成前、后極性(polarity);B.在遷移細(xì)胞前部，由肌動(dòng)蛋白聚合而形成片狀偽足、線狀偽足的突起(protrusion);C.跨膜受體-整合素與胞內(nèi)骨架蛋白連接，形成大小不等的黏附斑點(diǎn)(focal adhesion)，從而連接胞外基質(zhì)與胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白.當(dāng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些黏附可作為牽引位點(diǎn);D.細(xì)胞尾部的黏附解體和尾部牽縮(rear retraction)，細(xì)胞向前移動(dòng).闡明細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，是正確理解癌癥轉(zhuǎn)移、與尋找有效的治療措施的前提和基礎(chǔ).

1 細(xì)胞黏附的動(dòng)力學(xué)過程

細(xì)胞黏附，作為細(xì)胞轉(zhuǎn)移多步驟循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)，是指細(xì)胞與胞外基質(zhì)的物理相互作用，涉及跨膜糖蛋白受體家族-整合素(integrin)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和一系列胞質(zhì)蛋白［5-6］.整合素在結(jié)構(gòu)上為一雜二聚體，由一個(gè)α 亞基與一個(gè)β 亞基組合而成，分別具有結(jié)合配基的胞外區(qū)域，單一跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域，但僅β亞基的胞內(nèi)區(qū)域有與信號分子的結(jié)合位點(diǎn).當(dāng)其胞外區(qū)域與胞外配基，如纖粘蛋白(fibronectin)等結(jié)合后，導(dǎo)致整合素聚合成簇及胞內(nèi)區(qū)域的構(gòu)象變化，盡管其胞內(nèi)區(qū)域本身不具有酶活性，但成簇的整合素可激活黏附斑激酶FAK，使其397 位的酪氨酸磷酸化，與Src 激酶的SH2 區(qū)域結(jié)合，Src 磷酸化銜接蛋白或細(xì)胞骨架蛋白，如talin，paxillin，vinculin 等，從而使酪氨酸激酶、細(xì)胞骨架蛋白，通過FAK 的SH2，SH3 或富含脯氨酸區(qū)域，在整合素的β 胞內(nèi)區(qū)域相互結(jié)合形成細(xì)胞黏附，并與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相聯(lián)，使肌動(dòng)蛋白微絲重組，形成應(yīng)激纖維(stress fibers).這些新生的黏附(nascent adhesion)，逐漸長大，形成直徑1 μm 大小的圓形結(jié)構(gòu)即復(fù)合斑(focal complex).復(fù)合斑作為質(zhì)膜擴(kuò)展的牽引點(diǎn)，傳遞推動(dòng)力.當(dāng)黏附長成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，變得更大，更成熟時(shí)，即形成2 μm 寬，3～10 μm 長的所謂黏附斑(focal adhesion)［7-8］.Focal complex 為小的黏附，位于細(xì)胞前沿片狀偽足、線狀偽足的末端，可穩(wěn)定片狀、線狀偽足，傳遞推動(dòng)力，促進(jìn)細(xì)胞遷移;focal adhesion 為大的黏附，通常位于細(xì)胞尾部應(yīng)激纖維的末端，與胞外基質(zhì)緊密附著，抑制細(xì)胞遷移［9］.它們的分子組成相同，在成熟度上有差異.

在遷移細(xì)胞尾部，可觀察到黏附斑的解體(focal adhesion disassembly)，即黏附的釋放，使尾部收縮;但在細(xì)胞前沿，黏附斑的解體同時(shí)伴隨著新的黏附斑形成，因而稱為黏附斑的轉(zhuǎn)換(focal adhesion turnover).細(xì)胞黏附不僅建立了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與胞外基質(zhì)的緊密聯(lián)系，同時(shí)一系列結(jié)構(gòu)蛋白與調(diào)節(jié)蛋白組成的蛋白復(fù)合物，構(gòu)成了控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的信號通路的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)［10］.

2 Talin 在細(xì)胞黏附形成中的作用

最新研究表明，有超過180 種蛋白參與黏附的形成，這些蛋白或?yàn)榻Y(jié)構(gòu)蛋白，如銜接蛋白或骨架蛋白，直接或間接聯(lián)接整合素β 亞基的胞內(nèi)區(qū)域與胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白;或?yàn)檎{(diào)節(jié)蛋白，如激酶和信號蛋白，調(diào)控黏附相關(guān)蛋白間相互作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［11-12］.圖1［9］描述了參與黏附形成的主要蛋白間的相互作用，可以看出，僅talin，filamin 和α-actinin，既與整合素也與肌動(dòng)蛋白直接聯(lián)接.研究表明，與filamin 和α-actinin 相比，talin 蛋白，由于其結(jié)構(gòu)以及與其他蛋白的相互作用，在黏附的形成和解體的動(dòng)力學(xué)過程中，具有至關(guān)重要的作用.在敲除了talin 基因的胚胎干細(xì)胞中，黏附斑和應(yīng)激纖維均不能形成［13］.

圖1 細(xì)胞黏附中主要組成蛋白間的相互作用Fig.1 Interactions of main adhesion components in cell adhesion

Talin 基因有兩個(gè)亞型，talin1、talin2，其編碼的蛋白有74%的相似性［14］.目前，對talin2 的了解較少.在結(jié)構(gòu)上，talin1 為一包含2 541 個(gè)氨基酸，270 000 的蛋白大分子［15］.其全長蛋白分為球形N 端頭部與C 端尾部.頭部通稱為FERM 區(qū)域，可細(xì)分為F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3 亞區(qū)域，其中含有整合素β 胞內(nèi)區(qū)域、肌動(dòng)蛋白、黏附斑激酶FAK、跨膜蛋白layilin 的結(jié)合位點(diǎn).其尾部含有一個(gè)β 亞基、兩個(gè)肌動(dòng)蛋白和3 個(gè)骨架蛋白vinculin 結(jié)合位點(diǎn).從talin 蛋白結(jié)構(gòu)，可看出，其上可聯(lián)接整合素β 亞基，下可聯(lián)接肌動(dòng)蛋白，并與其他黏附組成蛋白直接或間接聯(lián)接，因而是整合細(xì)胞黏附形成、解體的動(dòng)力學(xué)過程的核心蛋白.

細(xì)胞黏附的形成，是指激活成簇的整合素將黏附各組成蛋白，征集進(jìn)入其β 亞基胞內(nèi)區(qū)域而形成新生細(xì)胞黏附的過程.Talin 在細(xì)胞黏附形成中，主要在整合素激活與征集其他細(xì)胞黏附的組成蛋白中起重要作用.talin 與整合素β 亞基胞內(nèi)區(qū)域的結(jié)合可使整合素處于激活狀態(tài)［16-17］.以RNA 干擾降低talin 表達(dá)可顯著抑制整合素激活［18］;在talin 低表達(dá)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染talin 基因，可使整合素恢復(fù)激活狀態(tài)［19］.其可能機(jī)制為:talin是激活整合素的關(guān)鍵因素——小G 蛋白R(shí)ap1A 的下游效應(yīng)分子，通過talin 與整合素的直接結(jié)合，傳遞Rap1A 信號給整合素［19］.通常，激活的整合素按順序依次，而非同時(shí)征集細(xì)胞黏附的各組成蛋白，進(jìn)入新生的細(xì)胞黏附中［20］.然而，何種蛋白處于該征集過程的最上游?一直以來，公認(rèn)是talin 最早進(jìn)入細(xì)胞黏附中［21-22］.但最近研究表明，黏附斑激酶FAK，先于talin 進(jìn)入細(xì)胞黏附.將FAK 結(jié)合talin 位點(diǎn)E1015 突變后，在新生的細(xì)胞黏附中，有FAK 存在，但沒有發(fā)現(xiàn)talin，表明FAK 可先于talin 進(jìn)入細(xì)胞黏附.現(xiàn)已確認(rèn)，talin處于征集過程中僅次于FAK 的第二位.FAK 需與talin 結(jié)合，將talin 征集到新生的黏附中.隨后，talin 位于所有其他蛋白的上游，直接或間接與其他黏附組成蛋白相互作用，構(gòu)成細(xì)胞黏附［23］.

3 Talin 在細(xì)胞黏附解體中的作用

與細(xì)胞黏附的形成相比，對黏附解體的調(diào)控機(jī)制目前卻還不甚明了.已知RhoA-ROCK 信號通路調(diào)控肌球蛋白收縮，使黏附斑解體［24-25］.微管在dynamin 和FAK 參與下，可誘導(dǎo)黏附斑解體［26］.但這些機(jī)制都還缺乏對具體黏附組成蛋白解體的研究.越來越多的研究表明，鈣依賴型蛋白酶Calpain(calcium-dependent protease)可能是誘導(dǎo)黏附斑解體的更重要原因.Calpain 位于黏附斑中，主要有Calpain 1 和Calpain 2 兩種亞型.一般認(rèn)為，細(xì)胞前沿的黏附斑的轉(zhuǎn)換，由Calpain1 完成;細(xì)胞尾部的黏附斑解體，由Calpain 2 完成［27］.Calpain 2 可將組成黏附斑的所有蛋白，如整合素β1 和β3 的胞內(nèi)區(qū)域，F(xiàn)AK，talin，paxillin，vinculin 等為底物而將其裂解，從而切斷整合素與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聯(lián)結(jié)，使黏附斑解體.

Calpain 2 對talin 蛋白的切割位點(diǎn)為其頭部L432 處，將其全長蛋白切割為頭部和尾部區(qū)域.點(diǎn)突變L432G 可有效抑制Calpain 對talin 蛋白的裂解，從而大大增加活細(xì)胞中黏附斑的持續(xù)時(shí)間［28］，促進(jìn)細(xì)胞黏附.最近，在talin 尾部E2492 處，發(fā)現(xiàn)一新的calpain 切割位點(diǎn)，但由于該位點(diǎn)處于talin 蛋白C 末端，可能對黏附斑解體的作用有限［29］.Calpain 對其他黏附組成蛋白，如paxillin，vinculin，zyxin 等的裂解，高度依賴對talin 蛋白的裂解［28］，即Calpain 只有裂解talin 后，才能有效裂解其他黏附組成蛋白.由此可見，Calpain 誘導(dǎo)的黏附斑解體，取決于對talin 蛋白的裂解，因而Calpain 介導(dǎo)的talin 蛋白的裂解在黏附解體中起關(guān)鍵作用.

Calpain 裂解蛋白的作用機(jī)制，已基本明確［30-31］.通常，Calpain 在毫摩級鈣離子濃度下，可處于激活狀態(tài).但在活細(xì)胞中，很難達(dá)到此種濃度.其激活機(jī)制為，在胞外表皮生長因子(EGF)刺激下，激活MAPK 通路，最終激活ERK.ERK 磷酸化Calpain 50 位的絲氨酸，從而激活Calpain.蛋白激酶A(PKA)，可磷酸化Calpain 269 位絲氨酸或379 位蘇氨酸，從而抑制Calpain 的激活，可抵消ERK 對Calpain 的激活效果［32］(圖2［27］).

圖2 Calpain 裂解蛋白的作用機(jī)制Fig.2 Mechanism of calpain-mediated proteolysis

4 Talin 與個(gè)體發(fā)育和腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

由于talin 在黏附的形成、解體中的重要作用，對talin 蛋白的研究已成為細(xì)胞黏附的熱點(diǎn)，其與個(gè)體發(fā)育和疾病的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，也得到普遍關(guān)注.敲除talin1 的小鼠胚胎受精后8.5～9.5 d 由于原腸胚發(fā)育停滯，導(dǎo)致胚胎致死［33］.在許多癌癥轉(zhuǎn)移病人中均存在Calpain 2 表達(dá)上調(diào)［34-35］，而Calpain 2 影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用主要是通過切割talin 而實(shí)現(xiàn)的，因而人們開始在talin 蛋白結(jié)構(gòu)中尋找影響Calpain 2 活性的位點(diǎn).對細(xì)胞黏附talin 頭部的蘇氨酸、絲氨酸質(zhì)譜分析表明，talin 頭部存在幾個(gè)高化學(xué)計(jì)算磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能控制Calpain 介導(dǎo)的對talin 蛋白的裂解，以及影響talin 與其他蛋白間的相互作用［15］，但目前還極少有talin 與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移直接相關(guān)的研究報(bào)道.有理由相信，隨著對talin 蛋白結(jié)構(gòu)、功能，以及與其他蛋白間相互作用的研究，talin 可成為治療包括癌癥等與細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)疾病的有用的分子靶標(biāo).

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