鄺良德　任永軍　謝曉紅　雷岷　李叢艷　鄭潔　郭志強(qiáng)　張翔宇　張翠霞　楊超　李勤　陳天寶

摘要：采用RT-PCR技術(shù)克隆家兔DGAT1部分基因片段，并采用半定量RT-PCR技術(shù)研究其在齊興肉兔不同組織中的表達(dá)譜。研究結(jié)果獲得了DGAT1基因960 bp的編碼序列，共編碼320個氨基酸。通過核苷酸和氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，家兔DGAT1基因與其他物種的相似性在81.7%～89.2%之間；遺傳距離分析表明，家兔與人的親緣關(guān)系最近，與牛的最遠(yuǎn)。組織表達(dá)譜分析表明，DGAT1基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、盲腸、淋巴結(jié)、背最長肌、皮下脂肪等多種組織中均有表達(dá)，且皮下脂肪中表達(dá)量最高，肺臟組織中表達(dá)量最低。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究DGAT1基因在家兔脂肪代謝中的生理功能提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：家兔；二?；视娃D(zhuǎn)酰基酶1（DGAT1）；半定量RT-PCR；組織表達(dá)；基因序列；遺傳距離

中圖分類號： S829.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0041-03

二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerolacyltransferase，DGAT）是脂肪細(xì)胞中甘油三脂合成過程中最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞甘油脂類的代謝中起重要作用，其作用機(jī)制是使二?；视停╠iacylglycerol，DAG）作用于脂肪酸?；纬扇８视停╰riacylglycerol，TAG）[1]。研究表明，DGAT基因?qū)游锛∪夂腿橹兄竞恳约爸舅峤M成有顯著影響，敲除DGAT1基因的小鼠雖然在腸內(nèi)能繼續(xù)合成甘油三酯，但不能在組織中沉積，也不能泌乳[2-6]。DGAT有2種類型：DGAT1和DGAT2，兩者有54%的同源性，但是分屬于不同的基因家族。DGAT1屬于包括?；o酶A、膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶ACAT1和ACAT2在內(nèi)的蛋白家族，在很多組織中都有表達(dá)，特別是在小腸、睪丸、脂肪、乳腺和皮膚中的表達(dá)量最高[7]。在小鼠上研究表明DGAT1的表達(dá)量與小鼠的肥胖程度及脂肪組織和骨骼肌中脂肪酸的含量及成分有關(guān)[8-9]。在牛上研究發(fā)現(xiàn)DGAT1基因的K232A突變對奶牛產(chǎn)奶性狀，尤其是乳脂量具有顯著影響[10，11]。Wu等研究結(jié)果表明，DGAT1基因?qū)ε５钠は轮居屑有孕?yīng)[12]。豬上的研究表明，DGAT1基因定位在SSC4p15，在這一區(qū)域內(nèi)存在可能影響豬生長速度、肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成的QTL[13-14]。

關(guān)于DGAT1基因的定位和結(jié)構(gòu)，國內(nèi)外學(xué)者在許多物種上進(jìn)行了深入細(xì)致的研究。人的DGAT1基因定位于HSA8q24.3，DNA總長度10 588 bp，含有17個外顯子和16個內(nèi)含子。小鼠的DGAT1基因位于15號染色體D3區(qū)，遺傳位置是46.9 cM，含有17個外顯子，16個內(nèi)含子。牛DGAT1基因位于14號染色體19 cM處，與微衛(wèi)星CSSM66緊密連鎖，基因全長14 117 bp，含有17個外顯子和16個內(nèi)含子。豬DGAT1基因定位于SSC4p15，與微衛(wèi)星SW2404緊密連鎖，cDNA全長1 935 bp[15-16]。目前，在家兔（Oryctolagus cuniculus）DGAT1基因研究方面，僅見 GenBank 上其基因預(yù)測序列的公布，有關(guān)家兔該基因的表達(dá)尚屬空白。本研究旨在通過RT-PCR技術(shù)對齊興肉兔DGAT1基因的cDNA進(jìn)行克隆，并利用半定量RT-PCR 技術(shù)分析DGAT1基因在不同組織中的表達(dá)規(guī)律，為該基因在家兔肌肉組織脂質(zhì)代謝中的功能研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及組織樣本采集 選取成年健康齊興肉兔公兔5只，來自四川省畜牧科學(xué)研究院種兔場。屠宰后立即采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、盲腸、淋巴結(jié)、背最長肌、皮下脂肪等組織樣品置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器及試劑 電動勻漿器（瑞士Polytron PT1200E）、Power Pac 3000電泳儀（Bio-Rad）、日本日立CR22g高速冷凍離心機(jī)、英國Biochrom公司的WPA Biowave核酸蛋白檢測儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。主要試劑包括Trizol試劑（Invitrogen）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ferments）、pMD19-T質(zhì)粒（TaKaRa）等。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中家兔DGAT1預(yù)測序列以及GAPDH mRNA序列，并采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計針對DGAT1基因的特異性克隆引物以及半定量RT-PCR引物（表1），引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取與cDNA模板合成 采用Trizol試劑法提取10種組織中的總RNA，用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量和完整性，質(zhì)量合格的RNA置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板參照TaKaTa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DGAT1基因的部分cDNA片段克隆 以凍存的肌肉組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增DGAT1基因部分cDNA片段。25 μL PCR反應(yīng)體系：滅菌超純水15.375 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 2 μL、PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.5 μL、10 μmol/L正反向引物各1 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.125 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，共34個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min，10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA回收試劑盒回收目的條帶?；厥债a(chǎn)物連接于PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序。DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2.4 DGAT1基因在齊興肉兔不同組織中的表達(dá)譜 利用凍存的齊興肉兔各組織cDNA為模板，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。經(jīng)過對DGAT1基因、GAPDH基因的半定量PCR體系及條件優(yōu)化后，25 μL PCR反應(yīng)體系：其中滅菌超純水15.8 μL、PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、cDNA 1.0 μL、10 μmol/L正反向引物各1.0 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸10 min，10 ℃保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Quantity one軟件分析，數(shù)據(jù)用DGAT1與GAPDH條帶的光密度比值表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用BioXM 2.6、DNAMAN等軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸同源性比對分析；利用MEGA 5.1構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹；定量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計分析軟件為SPSS 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGAT1基因片段擴(kuò)增以及重組質(zhì)粒的PCR檢驗

采用RT-PCR方法對齊興肉兔DGAT1基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條長度約為962 bp的特異性擴(kuò)增區(qū)帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。擴(kuò)增片段經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)后，挑取重組子，對陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定（圖2），結(jié)果得到1條與設(shè)計片段一致的條帶，表明目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。

2.2 DGAT1基因序列的同源性分析

將克隆測序得到的齊興肉兔DGAT1基因序列片段（圖2）與GenBank中收錄的人（NM_012079）、牛（NM_174693）、小家鼠（NM_010046）、豬（NM_214051）、犬（NM_214051）、綿羊（NM_214051）和黑猩猩（NM_010046）等物種DGAT1基因相應(yīng)序列相比較，發(fā)現(xiàn)DGAT1基因在常見物種間存在較高的相似性，其核苷酸相似性分別為89.1%、89.2%、81.7%、88.7%、87.9%、89.0%和89.1%。結(jié)果表明：哺乳動物的DGAT1基因編碼區(qū)序列比較保守。

2.3 基于系統(tǒng)進(jìn)化樹的DGAT1基因親緣關(guān)系分析

將本試驗克隆測序所獲得的DGAT1基因片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的人（NM_012079）、牛（NM_174693）、小家鼠（NM_010046）、豬（NM_214051）、犬（NM_214051）、綿羊（NM_214051）和黑猩猩（NM_010046）等物種DGAT1基因相應(yīng)序列用BioXM 2.6生物信息軟件翻譯成氨基酸序列，再利用MEGA 5.1軟件對所得到的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。樹枝長度表示親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，由圖可見，家兔與人具有最近的親緣關(guān)系，與牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 DGAT1基因在齊興肉兔不同組織的表達(dá)分析

采用GAPDH作為參照基因，采用半定量RT-PCR方法分別檢測了DGAT1基因mRNA在成年齊興肉兔不同組織中的表達(dá)情況，包括脂肪、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、回腸、胃、腎臟、大腦和肌肉共10個組織，結(jié)果（圖4）各組織中均表達(dá)DGAT1，DGAT1在脂肪組織中表達(dá)量最高， 并且脂肪、 肝臟以

及回腸組織中的表達(dá)量極顯著高于其他組織（P<0.01）。

3 討論與結(jié)論

肌內(nèi)脂肪沉積作為當(dāng)今研究的熱點問題，其內(nèi)在分子機(jī)理尚未完全清楚。國內(nèi)外研究表明，肌內(nèi)脂肪的沉積主要是肌肉內(nèi)脂肪細(xì)胞對甘油三酯的合成與分解的綜合結(jié)果表現(xiàn)，而參與脂肪合成和分解的脂肪代謝酶有許多種，因此，脂肪沉積的調(diào)控機(jī)制是一個十分復(fù)雜的過程[17-20]。DGAT1在調(diào)控脂肪代謝中起到重要作用，是甘油三酯合成過程中唯一的關(guān)鍵酶和限速酶，是肌內(nèi)脂肪沉積過程的重要參與者，其編碼基因的表達(dá)對肌內(nèi)脂肪沉積有著重要影響。目前，國內(nèi)外進(jìn)行了許多關(guān)于DGAT1基因的研究，但是有關(guān)家兔DGAT1基因的研究還未見報道。本試驗通過RT-PCR方法從肌肉組織中克隆得到了家兔DGAT1基因部分cDNA序列，此外，將該序列與NCBI收錄的其他物種DGAT1基因序列進(jìn)行同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，家兔DGAT1基因序列與其他常見物種間存在高度同源性，與牛、人和豬的DGAT1基因序列相比，相似性均在87%以上，將家兔DGAT1基因片段編碼氨基酸序列與其他常見物種相比，相似性均在95%以上，其中與人的核苷酸和氨基酸相似性均很高，與牛、綿羊的相似性較差。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，家兔與人具有最近的親緣關(guān)系，而其與牛的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果基本一致。

本試驗中，半定量RT-PCR結(jié)果表明，DGAT1基因mRNA在成年齊興肉兔脂肪、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、回腸、胃、腎臟、大腦和肌肉中都有不同程度的表達(dá)，其中在脂肪組織中表達(dá)量最高，在肺臟中表達(dá)量最低，這與王國富等在牛上的研究結(jié)果[21]稍有不同，這可能與物種的特異性有關(guān)?？傊珼GAT1在齊興肉兔各組織中不同的mRNA表達(dá)豐度說明其對不同組織中脂肪含量有著不同程度影響，可作為一個影響兔肉品質(zhì)性狀的候選基因。雖然DGAT1基因的表達(dá)對于脂肪沉積有重要影響，但脂肪沉積是受到許多代謝酶調(diào)控的一個綜合過程，下一步作者將對參與脂肪合成和分解的其他多種酶類編碼基因的表達(dá)調(diào)控及遺傳變異進(jìn)行深入研究，以便進(jìn)一步揭示肉兔脂肪沉積的內(nèi)在機(jī)制，為培育新品種提供理論基礎(chǔ)。

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