青稞品種肚里黃成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生

危文波　蔣禮玲　吳昆侖　遲德釗

摘要：以青稞品種“肚里黃”成熟胚為外植體，設(shè)置不同成熟胚切割方式、不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、不同激素及配比、不同碳源，研究對成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及綠苗分化的影響，以期為進(jìn)一步實現(xiàn)青稞的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，將刮碎的成熟胚接種在以麥芽糖為碳源，附加6 mg/L的2，4-D的MS培養(yǎng)基上最為合適，愈傷質(zhì)量最好；添加1.5 mg/L 6-BA和1.5 mg/L KT對愈傷組織的分化效果最佳，綠苗率達(dá)44.5%。研究結(jié)果表明，通過愈傷誘導(dǎo)和分化的優(yōu)化，肚里黃的愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率均可以達(dá)到較高水平，適合于作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。

關(guān)鍵詞：青稞；成熟胚；出愈率；愈傷誘導(dǎo)；植株再生

中圖分類號： S512.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0044-03

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以幼胚、花藥、分生組織等為外植體，通過細(xì)胞和基因工程技術(shù)定向改良大麥品種的研究，已經(jīng)取得了良好進(jìn)展[1-5]。但這些培養(yǎng)方法都受到大麥生長季節(jié)的限制，一年中取材時間有限，易受環(huán)境影響等不足。利用大麥種子的成熟胚為外植體，則具有取材方便、不受生長季節(jié)限制、能夠長年大量供應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來，受到了越來越多的研究者青睞[6-8]。青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.），屬禾本科大麥屬，在植物學(xué)上屬于栽培大麥的變種，因其籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱裸大麥，是青藏高原藏族人民的主糧，然而，青稞在其分子育種基礎(chǔ)性工作的青稞成熟胚研究報道較少。

本試驗選取青海省種植面積最大的青稞品種肚里黃為材料，以成熟胚為外植體，研究成熟胚不同處理方式以及不同培養(yǎng)條件對其愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生的影響，從而建立高效的青稞成熟胚再生體系，為青稞的遺傳轉(zhuǎn)化和品質(zhì)改良等分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試品種為肚里黃，是20世紀(jì)60年代從甘肅省甘南州引進(jìn)的青稞農(nóng)家品種。目前，肚里黃在青海省青稞種植區(qū)均有大面積種植。肚里黃種子由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物所青稞研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

愈傷組織誘導(dǎo)分別以MS、N6及B5大量+MS微量的3種培養(yǎng)基添加2 mg/L 2，4-D，分別添加不同濃度的2，4-D（2、4、6、8、10 mg/L），并設(shè)置不同的碳源（蔗糖、葡萄糖、麥芽糖）。繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基，不添加2，4-D。分化培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加KT和6-BA的不同組合。所有培養(yǎng)基均添加6 g/L植物凝膠，121 ℃下高溫滅菌20 min后使用。

1.3 種子處理及組織培養(yǎng)方法

1.3.1 種子處理和滅菌 選取當(dāng)年收獲、籽粒飽滿、大小一致的青稞種子，置75%乙醇中浸泡2～3 min；無菌水沖洗3～4次；再浸于5%次氯酸鈉中15 min；無菌水沖洗3～4次；無菌水浸泡12～18 h；接種前用5%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次后備用。

1.3.2 成熟胚的處理及初始愈傷組織的誘導(dǎo) 在超凈工作臺上將已滅菌的種子放在無菌濾紙上吸水后分別按照王興珍等采用的3種方式[6]處理：（1）沿胚軸完全切開（縱全切），接種半胚；（2）垂直胚軸完全橫切開（橫切），只接種有胚芽的50%；（3）將胚完全刮碎（刮碎），懸浮于愈傷培養(yǎng)基上。于培養(yǎng)箱中（25±1） ℃，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織。

1.3.3 愈傷組織的繼代和分化培養(yǎng) 將初始愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，25 ℃、光強(qiáng)450 lx下培養(yǎng)，每隔 7 d 繼代1次，誘導(dǎo)胚性愈傷組織；再將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，25 ℃、光強(qiáng)450 lx下分化出植株。

1.4 統(tǒng)計與分析

接種1周后統(tǒng)計不同處理下的出愈率，待胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上2周后，統(tǒng)計分化的綠點(diǎn)數(shù)和綠苗數(shù)。所有試驗結(jié)果采用Excel數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析、差異顯著性比較。

出愈率=誘導(dǎo)出愈傷組織的胚數(shù)/接種胚數(shù)×100%；

綠點(diǎn)數(shù)=分化出綠點(diǎn)的愈傷數(shù)/接種的愈傷數(shù)×100%；

再生苗數(shù)=分化出綠苗的愈傷數(shù)/接種的愈傷數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟胚切割方式對成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以肚里黃種子為材料，研究3種不同的成熟胚切割方式對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明，不同種子處理方式對愈傷組織的誘導(dǎo)率有極顯著影響。從圖1可以看出，胚刮碎處理的出愈率顯著高于其他2種處理。胚刮碎處理后的愈傷組織胚萌發(fā)較少，而且脫分化效果最佳，形成的愈傷組織呈淡黃色，質(zhì)地緊密，表明玻璃化不明顯。胚軸縱切和橫切時，會出現(xiàn)大量萌發(fā)的胚芽，且愈傷組織玻璃化嚴(yán)重。因此，本試驗均以刮碎的成熟胚進(jìn)行接種誘導(dǎo)愈傷組織。

2.2 誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MS、B5、N6）對成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響見圖2。從圖2可以看出，不同培養(yǎng)基對肚里黃成熟胚出愈率的影響達(dá)到極顯著水平。其中以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，肚里黃的出愈率最高，達(dá)71.1%；在N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的出愈率可達(dá)62.1%；而在B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的出愈率只有46.4%。研究結(jié)果表明，與其他2種培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基更適合作為青稞品種肚里黃成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2.2 不同碳源對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，比較3種不同的碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖）對肚里黃愈傷組織誘導(dǎo)的影響。從圖3可以看出，3種不同的碳源對肚里黃出愈率的影響達(dá)到顯著水平，其中以麥芽糖為碳源時，出愈率最高，為82.3%，其次是以蔗糖為碳源；而以葡萄糖為碳源時，出愈率最低，為70.0%。表明以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，麥芽糖為碳源時，青稞品種肚里黃出愈率得到大幅提高，因此，麥芽糖可代替葡萄糖作為青稞成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的碳源。

2.2.3 不同2，4-D濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 通過添加不同濃度的2，4-D研究肚里黃成熟胚愈傷誘導(dǎo)的情況。從表1可以看出，在2，4-D 濃度2～8 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著2，4-D濃度的升高，肚里黃的出愈率隨之升高。在 2，4-D 濃度為8 mg/L時，出愈率達(dá)到最高，為96.7%，隨著2，4-D濃度的進(jìn)一步升高，即10 mg/L時，反而抑制了愈傷組織的誘導(dǎo)。培養(yǎng)基中2，4-D的升高顯著降低了成熟胚的直接萌發(fā)出芽率，且愈傷組織質(zhì)量明顯優(yōu)于低濃度的愈傷組織，表明一定濃度2，4-D的添加對愈傷組織誘導(dǎo)存在促進(jìn)作用，也可顯著抑制胚胎的直接發(fā)生并有效改善愈傷質(zhì)量。

2.3 不同分化培養(yǎng)基對成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響

挑選質(zhì)地緊密的胚性愈傷組織，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類及濃度的激素，研究對成熟胚愈傷組織分化的影響。從表2可以看出，不同激素配比對肚里黃愈傷組織的分化有明顯影響。在培養(yǎng)基中添加1.5 mg/L 6-BA和 1.5 mg/L KT時，綠苗分化率最高，達(dá)到44.5%。在0～1.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，綠苗分化率是隨著6-BA濃度的升高而提高，而當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時，分化率反而降低；當(dāng)6-BA濃度在同一水平時，隨著KT濃度的升高，其出愈率隨之提高，表明激素在一定范圍內(nèi)可以促進(jìn)綠苗的分化，較高激素濃度會抑制肚里黃成熟胚愈傷組織的分化。

3 討論與結(jié)論

青稞愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生是建立青稞遺傳轉(zhuǎn)化體系的前提。而以成熟胚為外植體，取材方便、不受生長季節(jié)限制，可以常年大量供應(yīng)。研究結(jié)果表明，成熟胚作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時，誘導(dǎo)愈傷的同時，伴隨有胚發(fā)芽現(xiàn)象[6，8-9]。因此，通過成熟胚的不同處理方式及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，成熟胚也可以得到較好的愈傷組織。本研究與前人研究結(jié)果一致，認(rèn)為刮碎的成熟胚可以抑制胚發(fā)芽現(xiàn)象，并可以形成良好的愈傷組織。此外，添加外源激素可以促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)和分化再生[10-12]。尤其是2，4-D不僅能夠提高成熟胚的出愈率，而且可以抑制胚發(fā)芽現(xiàn)象，改善愈傷組織的質(zhì)量，因此，被認(rèn)為是影響成熟胚培養(yǎng)的主要因素之一[11，13-14]。在大麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中，王卉等的研究結(jié)果表明，在1～8 mg/L的范圍內(nèi)，2，4-D濃度對大麥成熟胚愈傷組織的出愈率影響較小，濃度間差異不明顯[15]。而潘向群等對不同基因型和2，4-D濃度的互作研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的大麥成熟胚高頻率誘導(dǎo)愈傷所需2，4-D濃度是不同的。本研究結(jié)果表明，青稞品種肚里黃，1～8 mg/L的2，4-D濃度范圍內(nèi)，肚里黃成熟胚的出愈率隨著2，4-D濃度升高而逐漸升高，而且顯著降低了成熟胚的直接萌發(fā)出芽率。此外，外源激素對愈傷組織的分化有明顯的影響，眾多研究表明，6-BA和KT的添加有利于芽的分化[16-18]，本研究結(jié)果與之一致，隨著6-BA和KT濃度的升高，其愈傷組織分化率隨之提高，在1.5 mg/L 6-BA和1.5 mg/L KT時，肚里黃綠苗率最高，達(dá)44.5%。

本研究結(jié)果表明，成熟胚的處理方式、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源和激素的種類和配比對青稞成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)及分化具有一定的影響。本試驗在刮碎的成熟胚接種以麥芽糖代替葡萄糖作為碳源MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，并添加6 mg/L的2，4-D，不僅明顯抑制了胚芽的萌發(fā)，而且提高了肚里黃成熟胚的出愈率。通過肚里黃成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化過程中的各項參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，使得其愈傷組織誘導(dǎo)率及綠苗分化率分別達(dá)到96.7%、44.5%，結(jié)果表明，肚里黃成熟胚可以作為較好的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。

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