氣腫疽梭菌PCR檢測(cè)方法的建立

云巾宴　任春宇　車達(dá)　段雪巖　司唯　金鑫

摘要：為建立氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）的快速檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank中氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素CctA基因序列（登錄號(hào)：JQ692583.1）設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，以氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C54-1全基因組DNA為模板，建立了牛氣腫疽梭菌的PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行了特異性、敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，建立的氣腫疽梭菌PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增出的片段大小為501 bp，與GenBank上氣腫疽梭菌的同源性達(dá)99.4%，且該方法與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌和巴氏桿菌等病原體無交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)濃度為12.30 fg/μL。結(jié)果表明，建立的PCR檢測(cè)方法具有特異、敏感、高效等優(yōu)點(diǎn)，與其他診斷方法相比更適用于氣腫疽梭菌的診斷。

關(guān)鍵詞：氣腫疽梭菌；細(xì)胞毒素CctA；PCR診斷

中圖分類號(hào)： S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0053-03

氣腫疽別稱黑腿病，是由氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的以皮下組織和肌肉豐滿部位發(fā)生氣性、炎性腫脹，按壓之有捻發(fā)音為特征的急性、熱性和敗血性傳染病[1]。病牛是本病的主要傳染源，但并不直接傳染給健康牛，而是隨污染的土壤經(jīng)飼料或飲水間接進(jìn)入消化道而感染[2]。其芽孢能在土壤中長期生存，成為持久的傳染源。本病一年四季均可發(fā)生，尤以炎熱干旱的夏季容易發(fā)生，嚴(yán)冬則較為少見；呈地方性流行，低溫高濕、低濕山谷或低洼地區(qū)更易發(fā)生[3]。

由于氣腫疽梭菌的生長速度和其他梭狀芽孢桿菌相比較為緩慢[4-5]，因其與其他梭狀芽孢桿菌易發(fā)生交叉感染，所以很難從病原學(xué)和免疫學(xué)的角度對(duì)其病原體進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)[6]；因此建立快速高效的檢測(cè)方法顯得尤為重要。近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，逐步建立了一些新的血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷方法。本試驗(yàn)根據(jù)氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素CctA基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，旨在建立靈敏、準(zhǔn)確的針對(duì)氣腫疽梭菌的PCR檢測(cè)方法，對(duì)已發(fā)生氣腫疽病的牧場(chǎng)其他個(gè)體進(jìn)行快速、高效的診斷，并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣本及試劑

試驗(yàn)樣本為氣腫疽梭菌C54-1標(biāo)準(zhǔn)株；Ex Taq DNA 聚合酶、DNTP、pMD 18-T Simple vector均購自大連寶生物工程有限公司；NI-DL3000 DNA marker購自Newbio industry公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒少量提取試劑盒購自美國Omega生物技術(shù)公司；D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌和巴氏桿菌均由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素CctA基因序列（登錄號(hào)：JQ692583.1），用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了1對(duì)引物P1（5′-CGGGATCCGGTGGGTATTATCAAGC-3′）、P2（5′-CCCTCGAGAGTTCCTTTTGGTGC-3′），由北京新產(chǎn)業(yè)公司合成。

1.3 基因組DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法提取氣腫疽梭菌菌體核酸DNA。

1.4 PCR反應(yīng)體系及條件

PCR在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，雙蒸水16.25 μL、10×Ex Taq buffer 2.50 μL、DNA模板 2.00 μL、dNTP 2.00 μL和P1、P2各1.00 μL、Eq Taq 0.25 μL，共計(jì)25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，48.8 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及測(cè)序

PCR產(chǎn)物50 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的條帶；將回收產(chǎn)物與pMD 18-T simple vector進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化進(jìn)DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，繼而接種于含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)菌落于含有氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定后將質(zhì)粒送往上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中氣腫疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因進(jìn)行同源性比較。

1.6 特異性試驗(yàn)

將D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌的DNA按照氣腫疽梭菌的DNA濃度稀釋，用本研究建立的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并設(shè)陰性對(duì)照。

1.7 敏感性試驗(yàn)

提取氣腫疽梭菌菌體DNA，測(cè)其D260 nm值，將DNA模板按1 ∶ 10比例連續(xù)稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此來確定本PCR方法的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣腫疽梭菌CctA基因目的片段的PCR擴(kuò)增

以氣腫疽梭菌菌體DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出了大小為501 bp的目的片段（圖1）。

2.2 目的基因的序列分析

將測(cè)序得到的結(jié)果與GenBank中氣腫疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因序列（JQ692583.1）進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，核苷酸序列同源性達(dá)99.4%，共存在3處突變（圖2），表明該引物適用于氣腫疽梭菌的檢測(cè)。

2.3 特異性試驗(yàn)

分別以氣腫疽梭菌、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌、E型產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌和巴氏桿菌的基因組DNA為模板，按照“1.4”節(jié)所述的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以滅菌去離子水作陰性對(duì)照，后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，只有氣腫疽梭菌擴(kuò)增出目的條帶，而其他均未出現(xiàn)目的條帶，表明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性（圖3）。

2.4 敏感性試驗(yàn)

取氣腫疽梭菌菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)品，按1 ∶ 10倍比稀釋后，用上述PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察，結(jié)果表明，該P(yáng)CR最低檢測(cè)量為12.30 fg/μL（圖4）。

3 討論

氣腫疽梭菌是引起氣腫疽的病原體，常隨污染的土壤經(jīng)飼料或飲水間接進(jìn)入消化道而感染[2]，也可經(jīng)皮膚傷口或通過吸血昆蟲叮咬進(jìn)行傳播[7]。該菌的芽孢潛伏期長、存活能力力強(qiáng)，能在土壤中長期生存，可成為持久傳染源，故很難從根本上預(yù)防和控制本病的發(fā)生及流行，這些特性嚴(yán)重制約了

畜牧業(yè)的發(fā)展。而隨著其易感群體的逐漸擴(kuò)大，氣腫疽梭菌也越來越多地威脅到了人類的安全。

目前常用的檢測(cè)手段存在一定的弊端，病原學(xué)檢查和免疫學(xué)試驗(yàn)都很容易與梭菌屬的其他細(xì)菌發(fā)生干擾，并不能達(dá)到良好的效果。與常規(guī)檢測(cè)方法相比，分子生物學(xué)方法更有優(yōu)勢(shì)，可準(zhǔn)確檢測(cè)低含量的病原菌。

本試驗(yàn)以牛氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素A（CctA）基因?yàn)榛A(chǔ)建立的PCR檢測(cè)方法，所獲得的序列與GenBank（登錄號(hào)JQ692583.1）上公布的序列同源性為99.4%，與產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌等病原體無交叉反應(yīng)，證明其具有很好的特異性；最少可檢測(cè)到12.30 fg/μL的DNA，證明其具有較好的敏感性；說明本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法可廣泛應(yīng)用于對(duì)臨床樣本進(jìn)行快速、高效的診斷，與其他診斷方法相比更適用于氣腫疽梭菌的診斷。

參考文獻(xiàn)：

[1]王正興. 山區(qū)牛氣腫疽診斷與防制[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011（2）：107.

[2]郭洪友，鄭 聃. 牛氣腫疽病的診治[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（7）：367，369.

[3]陸安法，徐官紅，簡(jiǎn)廷安，等. 牛氣腫疽的防制[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24（6）：131-131.

[4]白 實(shí)，郭宇鵬，李艷華. 敦化地區(qū)黃牛氣腫疽的防治與診斷[J]. 吉林畜牧獸醫(yī)，2007，28（6）：38-39.

[5]Kuhnert P，Krampe M，Capaul S E，et al. Identification of Clostridium chauvoei in cultures and clinical material from blackleg using PCR[J]. Veterinary Microbiology，1997，57（2/3）：291-298.

[6]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.

[7]孫 瑛，雷國云，于林潔. 牛氣腫疽診斷與綜合防治[J]. 中國畜禽種業(yè)，2008（17）：59-60.劉廣卿，丁 芳，孫喜云，等. 速生高抗雄性楊的組織培養(yǎng)與快繁研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：55-56.