通信作者：王志紅(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤發(fā)生機(jī)制研究。E-mail：misswang19811981@163.com

丙戊酸促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬性死亡

王雪晶1，滕軍放1，丁雪冰1，馬明明2，王志紅3

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450052；

2.河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450003；

3.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014)

[摘要]目的探討丙戊酸(VPA)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬性死亡的調(diào)控。方法用含不同濃度的VPA培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)細(xì)胞損傷，單丹磺酰尸胺(MDC)染色評(píng)價(jià)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酸性自噬泡的形成，Western blotting法檢測(cè)巨自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，VPA孵育48 h后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低，且具有劑量依賴性(P<0.05)；SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH明顯增高，且具有劑量依賴性(P<0.05)；VPA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論VPA誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞細(xì)胞自噬性死亡，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的手段。

[關(guān)鍵詞]丙戊酸；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；細(xì)胞自噬性死亡

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：81241046)

作者簡(jiǎn)介：王雪晶(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)退行性疾病研究。E-mail：ballet8114@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.02.001

[中圖分類(lèi)號(hào)]R730.264;R730.23

收稿日期：(2015-02-10)

Valproic Acid Induced Autophagic Cell Death of SH-SY5Y Cells

Wang Xuejing1,Teng Junfang1,Ding Xuebing1,Ma Mingming2,Wang Zhihong3

(1.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;

2.DepartmentofNeurology,HenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China;3.Departmentof

ObstetricsandGynecology,theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Abstract[]ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of valproic acid (VPA) on autophagic cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells.MethodsWe used different concentration of VPA to treat SH-SY5Y cells.MTT was used to detect the viability of SH-SY5Y cells,layered double hydroxides (LDH) was used to evaluate the damage of cells,monodansylcadaverine (MDC) staining was used to mark autophagic vacuoles.The autophagy-related protein expressions of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Beclin-1 were detected by Western blotting analysis.ResultsAfter treatment of VPA for 48 hours,the viability of SH-SY5Y cells were significantly decreased in dose-dependent manner (P<0.05); and VPA increased LDH level in culture media in dose- dependent manner (P<0.05).Compared with the control group,the levels of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin-1 were significantly increased in the VPA treatment groups (P<0.05).ConclusionVPA induces the autophagic cell death of neuroblastoma SH-SY5Y cells,VPA thus may be a new target for treatment of neuroblastoma.

[Key words]valproic acid; neuroblastoma; autophagic cell death

丙戊酸(valproic acid，VPA)為經(jīng)典的組蛋白乙?；种苿?，廣泛運(yùn)用于抗癲癇的治療中[1]。以往研究[2]證實(shí)，組蛋白乙酰化抑制劑具有抗腫瘤的作用，可能的分子機(jī)制為抑制HDAC活性，使組蛋白失去乙?；癄顟B(tài)，因此細(xì)胞核中組蛋白乙?；教岣?，激活核小體內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子被激活，細(xì)胞阻滯在G1或G2/M期，阻止異常增殖而具有抗腫瘤作用[3]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的顱外原發(fā)腫瘤，目前尚無(wú)有效治療手段。本實(shí)驗(yàn)以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y為研究對(duì)象，探討VPA通過(guò)調(diào)控SH-SY5Y細(xì)胞自噬水平誘導(dǎo)其死亡的具體機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%左右，以消化液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% EDTA)消化，14比例稀釋、傳代培養(yǎng)。

1.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板(密度為2×103/孔)，次日對(duì)照組給予常規(guī)DMEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分為3個(gè)濃度組，分別加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加10 μL MTT和90 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育2 h，棄去液體，加入150 μL DMSO振蕩溶解，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(A)值，細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.3LDH釋放檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，按照乳酸脫氫酶(layered double hydroxides，LDH)試劑盒說(shuō)明操作并計(jì)算LDH釋放率。

1.4MDC檢測(cè)細(xì)胞自噬空泡變化單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色檢測(cè)自噬空泡的標(biāo)志物，通過(guò)MDC染色判斷細(xì)胞自噬過(guò)程。SH-SY5Y細(xì)胞分別加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，培養(yǎng)48 h后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛，4 ℃固定10 min，PBS洗3遍，加入終濃度為50 μmol·L-1的MDC染色液，37 ℃下孵育80 min，PBS洗5遍，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬空泡的變化。

1.5Western blot法分析蛋白表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞分別加入0、1、2 mmol·L-1的VPA，培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，做SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。膜用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗Beclin 1(1800)、抗LC3(1300)抗體，4 ℃過(guò)夜。TBST漂洗3次，加人過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(15 000)，置于水平脫色搖床上孵育2 h，TBS漂洗3次，ECL光化學(xué)法顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描，測(cè)定各條帶積分光密度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值。

2結(jié)果

2.1VPA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率分別為(97.0±9.1)%、(76.2±10.2)%、(52.1±16.2)%，處理組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　VPA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05

2.2LDH活性檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說(shuō)明操作并計(jì)算LDH釋放率。LDH釋放率(%)=上清LDH/總LDH×100%，以對(duì)照組為 100.0%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較。0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放率為(100.0±4.3)%、(133.0±8.5)%、(152.0±7.3)%，后2組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2　VPA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放的影響

注：1)與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3MDC熒光檢測(cè)自噬體形成SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，MDC染色結(jié)果顯示，VPA導(dǎo)致MDC染色信號(hào)增強(qiáng)，自噬空泡聚集增多，表明VPA誘導(dǎo)了細(xì)胞巨自噬的發(fā)生。見(jiàn)圖3。

圖3　MDC熒光檢測(cè)顯示自噬小體的形成

A：VPA 0 mmol·L-1;B:VPA 1 mmol·L-1;C:VPA 2 mmol·L-1

2.4Western blot分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1水平的變化SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)0、1、2 mmol·L-1VPA作用48 h后，后2組LC3-Ⅱ表達(dá)水平逐漸上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸上調(diào)，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，與對(duì)照組比較，后2組Beclin-1表達(dá)水平逐漸上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4　Western blot法檢測(cè)VPA對(duì)LC3及Beclin-1水平的調(diào)控

3討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童期最常見(jiàn)的外周神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，占此年齡段腫瘤的30%，是由交感神經(jīng)細(xì)胞惡性增殖演變而來(lái)[4]。該腫瘤惡性程度高，多數(shù)患者雖經(jīng)化療、放療及生物治療生存率仍很低，探索能夠延長(zhǎng)生存期及提高患者的生活質(zhì)量的新藥物勢(shì)在必行[5]。

細(xì)胞壞死和凋亡是細(xì)胞死亡的2種主要方式。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，包括Ⅰ型(細(xì)胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性細(xì)胞死亡)[6]。細(xì)胞自噬過(guò)程是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制。蛋白或細(xì)胞器包被進(jìn)入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而降解其所包裹的內(nèi)容物，藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[7]。因此，保持一種基礎(chǔ)低水平的自噬活性對(duì)細(xì)胞的生理活動(dòng)至關(guān)重要，然而細(xì)胞中自噬過(guò)度激活將誘發(fā)細(xì)胞死亡[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，VPA可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞巨自噬的激活，導(dǎo)致巨自噬標(biāo)志物L(fēng)C3及Beclin-1表達(dá)上調(diào)，MDC染色顯示VPA孵育后自噬小體呈現(xiàn)明顯聚集，且呈劑量依賴性。進(jìn)一步研究證實(shí)，VPA誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞活力下降，LDH釋放增加，以上結(jié)果證實(shí)VPA誘導(dǎo)了SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，增加了SH-SY5Y細(xì)胞的死亡。綜上所述，本研究證實(shí)VPA能夠通過(guò)誘導(dǎo)巨自噬上調(diào)促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的死亡。且本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著VPA濃度的增加，SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞損傷逐漸加重，呈現(xiàn)劑量依賴性?？傊琕PA通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制了SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡過(guò)程，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供了新的治療手段及理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chateauvieux S,Morceau F,Dicato M et al.Molecular and therapeutic potential and toxicity of valproic acid[J].J Biomed Biotechnol,2010,2010.

[2]Karpiak SE,Mahadik SP.Reduction of cerebral edema with GM1 ganglioside[J].J Neurosci Res,1984,12(2/3):485-492.

[3]Wagner T,Brand P,Heinzel T et al.Histone deacetylase 2 controls p53 and is a critical factor in tumorigenesis[J].Biochim Biophys Acta,2014,1846(2):524-538.

[4]Schleiermacher G,Janoueix-Lerosey I,Delattre O.Recent insights into the biology of neuroblastoma[J].Int J Cancer,2014,135(10):2249-2261.

[5]Irwin MS,Park JR.Neuroblastoma:paradigm for precision medicine[J].Pediatr Clin North Am,2015,62(1):225-256.

[6]Lalaoui N,Lindqvist LM,Sandow JJ et al.The molecular relationships between apoptosis,autophagy and necroptosis[J].Semin Cell Dev Biol,2015.

[7]Naponelli V,Modernelli A,Bettuzzi S et al.Roles of Autophagy Induced by Natural Compounds in Prostate Cancer[J].Biomed Res Int,2015,2015:121826.

[8]Muzes G,Constantinovits M,Furi I et al.Interaction of autophagy and Toll-like receptors:a regulatory cross-talk--even in cancer cells?[J].Curr Drug Targets,2014,15(8):743-752.