劉小賢 汪衛(wèi) 王圳 鄭紅霞 馬紀(jì)林 于健寧 張?chǎng)?/p>

●論 著

轉(zhuǎn)化生長因子-β1對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響

劉小賢 汪衛(wèi) 王圳 鄭紅霞 馬紀(jì)林 于健寧 張?chǎng)?/p>

目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚的影響。方法體外培養(yǎng)SD大鼠原代腹膜間皮細(xì)胞，靜止24h后，采用RT-PCR檢測(cè)TGF-β1（10ng/ml）刺激后0、3、6、12、24、48h單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白介素-6（IL-6）、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）、纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）mRNA的表達(dá)情況；Western blot檢測(cè)TGF-β1（10ng/ml）刺激后0、4、12、24、48h CollagenⅠ和PAI-1表達(dá)情況；ELISA法檢測(cè)MCP-1和IL-6表達(dá)情況。結(jié)果TGF-β1處理6h后MCP-1、IL-6和PAI-1mRNA即開始逐漸升高，與0h組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），24h后顯著升高（均P＜0．01）；TGF-β1處理12h后CollagenⅠmRNA表達(dá)開始明顯升高，與0h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），24h后有顯著升高（P＜0．01）；TGF-β1處理4h后IL-6表達(dá)水平升高（P＜0．05），24h后顯著升高（P＜0．01）；處理12h后MCP-1和PAI-1表達(dá)水平較0h明顯升高（P＜0．05），處理24h后CollagenⅠ表達(dá)水平顯著升高（P＜0．05）；TGF-β1顯著增加MCP-1、IL-6、CollagenⅠ、PAI-1及其mRNA的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論TGF-β1可能通過誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞炎癥因子上調(diào)表達(dá)和ECM積聚導(dǎo)致腹膜纖維化。

腹膜間皮細(xì)胞 炎癥因子 細(xì)胞外基質(zhì) 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

長期腹膜透析患者常由于腹膜纖維化導(dǎo)致超濾功能喪失而退出透析治療。腹膜纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及炎性細(xì)胞的浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積聚及腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化等。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是公認(rèn)的促纖維化因子，但其具體機(jī)制目前并未完全清楚。筆者之前研究已經(jīng)證實(shí)，TGF-β1可以誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[1]；因此，筆者進(jìn)一步觀察TGF-β1對(duì)大鼠腹膜間皮細(xì)胞炎性因子、ECM積聚的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠（體重150～180g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），TGF-β1（美國R&D Systems公司），羊抗Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）抗體（美國CST公司），兔抗大鼠纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）抗體（美國Santa Cruz公司），小鼠抗β-actin抗體（美國CST公司），DPI（美國CST公司），胎牛血清、DMEM/F12（美國Gibco公司），羊抗兔IgG抗體（美國CST公司），RNA提純?cè)噭┖校绹鳬nvitrogen公司），大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、IL-6ELISA檢測(cè)試劑盒（美國Biosource公司），其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)、分組及觀察指標(biāo)

1.2.1 分離與培養(yǎng) 取大鼠，予肌肉注射10%水合氯醛 0.5～0.8ml。麻醉后向大鼠腹腔內(nèi)注射 20～30ml 0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液。1h后斷頸處死大鼠，75%乙醇全身浸泡消毒10min。將大鼠仰面放置于超凈工作臺(tái)上，沿腹白線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內(nèi)的消化液，移入15ml離心管中。1 500r/min離心15min，棄上清液，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕用吸管吹打使之成為細(xì)胞混懸液，分裝于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。再加入培養(yǎng)基使之總體積達(dá)到4～5ml，放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3d更換1次完全培養(yǎng)基。常規(guī)傳代，取第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及觀察指標(biāo) 靜止24h后，將細(xì)胞隨機(jī)分成對(duì)照組（即0h組）和TGF-β1（10ng/ml）刺激組，采用半定量RT-PCR法觀察記錄TGF-β1處理0、3、6、12、24、48h后大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1、IL-6、PAI-1和CollagenⅠmRNA表達(dá)情況，分別采用ELISA和Western blot法觀察記錄TGF-β1處理0、4、12、24、48h后MCP-1、IL-6、CollagenⅠ和PAI-1表達(dá)情況。

1.3 半定量RT-PCR提取細(xì)胞總RNA 按照Trizol Reagent說明書進(jìn)行操作。Biophotometry核酸測(cè)定儀（美國Eppenddorf公司）測(cè)定總RNA濃度，貯存于-80℃冰箱。按照RevertAidTM First Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國MBI公司）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取約5μg的RNA樣本，以多聚寡核苷酸[Oligo（dT）18]為引物，在RevertAidTM M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA。條件為70℃變性5min，37℃退火5min，42℃延伸60min，70℃孵育10min。合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。采用MBI公司PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，72℃孵育10min（退火溫度及循環(huán)周期依據(jù)引物和PCR產(chǎn)物而定）。引物設(shè)計(jì)按文獻(xiàn)[2]或自行設(shè)計(jì)，所有引物由上海生工合成，合成序列見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）進(jìn)行信號(hào)吸光度分析。結(jié)果由電泳圖的灰度值與內(nèi)參灰度值的比值表示。

表1 PCR引物序列

1.4 Western blot檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[3]，取各組細(xì)胞，棄上清液，PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液，收取蛋白質(zhì)，4℃12 000r/min離心15min，BCA法測(cè)定濃度。取30μg的蛋白標(biāo)本，10%聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上電泳，電壓90V 30min，140V 60min。室溫100V轉(zhuǎn)膜90min。5%脫脂奶粉封閉1h，TBST洗3次，加入一抗（羊抗大鼠CollagenⅠ抗體、兔抗大鼠PAI-1抗體），4℃過夜。TBST洗3次，10min/次，HRP標(biāo)記的二抗（小鼠抗羊IgG抗體、羊抗兔IgG抗體）室溫孵育1h，TBST洗3次，顯色并曝光成像。掃描圖像并用圖像分析軟件進(jìn)行信號(hào)吸光度分析。

1.5 ELISA檢測(cè) 將試劑盒室溫下放置20min以上，按說明書方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋。取出相應(yīng)標(biāo)本的上清液，離心，15min內(nèi)加完全部的樣品。配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，10倍稀釋鏈酶抗生物素蛋白，5倍稀釋洗板液，每孔加50μl孵育稀釋液，留1個(gè)孔作為顯色劑空白，將各濃度標(biāo)準(zhǔn)品依次加入相應(yīng)各孔。另1個(gè)孔標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100μl作為零對(duì)照孔，其他孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl繼之加樣品50μl（需復(fù)孔），輕輕敲打反應(yīng)板邊緣混勻，除顯色劑空白，每孔加50μl生物素結(jié)合的MCP-1或IL-6抗體，輕輕敲打反應(yīng)板邊緣混勻，覆蓋反應(yīng)板膜，室溫下孵育90min，甩去板內(nèi)液體，除顯色劑空白，每孔加鏈酶抗生物素蛋白100μl，室溫下孵育30min，甩去板內(nèi)液體，，每孔加顯色劑100μl，室溫下孵育30min，每孔加100μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算MCP-1、IL-6水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1處理后各時(shí)點(diǎn)大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1、IL-6、PAI-1和CollagenⅠmRNA表達(dá)情況的比較見圖1。

圖1 TGF-β1誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞MCP-1、IL-6、Collagen I及PAI-1mRNA表達(dá)的情況（M：Marker；與0h比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，TGF-β1處理6、12、24、48h后MCP-1、IL-6和PAI-1mRNA均較0h明顯升高（P＜0.05或0.01），處理12、24、48h后CollagenⅠmRNA表達(dá)也較0h明顯升高（P＜0.05或0.01）。

2.2 TGF-β1處理后各時(shí)點(diǎn)MCP-1、IL-6、CollagenⅠ和PAI-1表達(dá)情況的比較 見圖2、表3。

表3 TGF-β1處理后各時(shí)點(diǎn)MCP-1、IL-6水平的比較（pg/ml）

由圖2、表3可見，TGF-β1處理4、12h后IL-6水平較0h升高（P＜0.05），24、48h后顯著升高（P＜0.01）；處理12、24、48h后MCP-1和PAI-1水平較0h明顯升高（P＜0.05或0.01），處理24、48h后CollagenⅠ表達(dá)水平較0h明顯升高（P＜0.05或0.01）。

3 討論

TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)致纖維化因子，可以導(dǎo)致肝、肺、心臟及腎臟等諸多器官發(fā)生纖維化[4-7]，主要通過下列幾方面參與纖維化的病理過程：（1）促進(jìn)上皮、間皮細(xì)胞向肌成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT），TGF-β1可誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞表型改變，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，肌成纖維細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的增加是細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚的重要原因；（2）上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，TGF-β1可上調(diào)CollagenⅠ、CollagenⅣ型膠原、纖連蛋白和層連蛋白的表達(dá)[8]；（3）抑制降解基質(zhì)蛋白酶的活性，TGF-β1能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶、凝血酶原激活物和膠原酶等的活性[9]；（4）活化上述蛋白酶的抑制劑，如基質(zhì)蛋白酶抑制劑（TIMPs）和PAI-1[9]；（5）作用于臟器固有細(xì)胞和浸潤細(xì)胞，產(chǎn)生多種活性細(xì)胞因子包括MCP-1、IL-6、IGF、PDGF等。TGF-β1還是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在T細(xì)胞和其他非淋巴細(xì)胞中起抗炎因子的作用。

細(xì)胞浸潤在腹膜纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用。MCP-1是一種對(duì)單核/巨噬細(xì)胞有強(qiáng)烈趨化作用的細(xì)胞因子，可在多種細(xì)胞中產(chǎn)生，其中包括單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腎組織細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞，參與炎癥和組織纖維化的形成[2,10]。IL-6是一種可由多種細(xì)胞包括單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞分泌的具有多種功能的細(xì)胞因子，其功能包括調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)急性期蛋白的產(chǎn)生、參與骨代謝及造血。IL-6在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。研究顯示TGF-β1在多種細(xì)胞包括腎小管上皮細(xì)胞、人單核細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、人肺成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中均可上調(diào)IL-6的表達(dá)[11-14]。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1可上調(diào)大鼠腹膜間皮細(xì)胞MCP-1、IL-6及其mRNA的表達(dá)，提示TGF-β1是重要的促炎癥細(xì)胞因子，但TGF-β1促進(jìn)MCP-1及IL-6表達(dá)的信號(hào)通路并不十分明確。Cheng等[14]報(bào)道TGF-β1通過激活ERK、p38和ROS，刺激系膜細(xì)胞表達(dá)MCP-1，但沒發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活。還有研究認(rèn)為TGF-β1可能通過MAPK通路，激動(dòng)蛋白-1（AP-1）和JunD同源二聚體使人的肺成纖維細(xì)胞生成IL-6增多[15]。纖維化除了炎癥細(xì)胞和因子的參與，另外一個(gè)特點(diǎn)即是過量的ECM如膠原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型、纖維連接蛋白和層連蛋白，在腹膜間皮細(xì)胞積聚及成纖維細(xì)胞增生。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積依賴于ECM合成與分解代謝的平衡。

TGF-β1促進(jìn)ECM合成的作用體現(xiàn)于多個(gè)環(huán)節(jié)，一方面上調(diào)基質(zhì)成分基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等步驟，如上調(diào)膠原和纖維粘連蛋白的基因表達(dá)，加強(qiáng)膠原和纖維粘連蛋白的合成，促進(jìn)胞外基質(zhì)受體的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白形成等，促進(jìn)ECM的沉積；另一方面通過減少基質(zhì)降解蛋白酶的合成和分泌，增加降解酶阻制劑的合成和分泌抑制基質(zhì)的降解。調(diào)節(jié)ECM代謝的ECM降解酶類纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物（PAs/PAIs）的表達(dá)與活性異常在ECM積聚中發(fā)揮重要的作用。PAs/PAIs是調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)活性的重要物質(zhì)，不僅起著維持血液中凝血與纖溶平衡的作用，而且參與維持ECM降解的動(dòng)態(tài)平衡。PAs可由多種細(xì)胞生成和分泌，如T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等都可生成和分泌PAs。PAs分為組織型（tPA）和尿激酶型（uPA）兩種。目前認(rèn)為tPA的生理功能主要是作為纖溶的生理性激活劑，維持纖溶內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其在ECM降解和重塑過程中所起的作用還需進(jìn)行探討。uPA主要參與ECM降解和重塑，能夠降解層粘連蛋白、纖維連接蛋白、IV膠原等多種糖蛋白。PAIs是PAs的生理性特異抑制物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種不同類型的PAIs（PAI-1、PAI-2、PAI-3、PAI-4），均有抑制PAs的作用，其中PAI-1既是PAI的主要形式，也是PAs最重要的抑制劑，所以目前對(duì)PAIs的表達(dá)調(diào)控的研究也主要集中在PAI-1。近年來研究表明，地塞米松、LPS、IL-1、IL-6、AngⅡ、TNF-α、EGF等對(duì)PAI-1均具有上調(diào)作用，而多肽類激素如促卵細(xì)胞激素（FSH）和黃體生長素（LH）對(duì)PAI-1表達(dá)則有下調(diào)作用[16-20]。許多腎臟疾?。ㄈ缒I小球腎炎、IgA腎病、狼瘡性腎炎等），腎組織局部PAI-1的變化失調(diào)，表現(xiàn)為uPA或tPA表達(dá)下調(diào)，而PAI-1表達(dá)上調(diào)。本研究顯示，TGF-β1可上調(diào)大鼠腹膜間皮細(xì)胞CollagenⅠ和PAI-1及其mRNA的表達(dá)，從而使ECM沉積增加和降解減少，證實(shí)PAs/PAI-1在腹膜纖維化的發(fā)生中也起著重要的作用。

目前已知TGF-β1可上調(diào)多種細(xì)胞PAI-1的表達(dá)，但尚不清楚TGF-β1通過怎樣的信號(hào)傳遞途徑調(diào)節(jié)PAI-1的表達(dá)。有研究顯示，TGF-β1可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS，生成的ROS介導(dǎo)了由TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞PAI-1及其mRNA表達(dá)上調(diào)和活性的增強(qiáng)，長期給予抗氧化劑?；撬峥捎行б种颇I小球PAI-1及其mRNA表達(dá)的上升[21]。

綜上所述，TGF-β1促進(jìn)組織和器官纖維化的作用是多方面的，除誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化外，上調(diào)炎癥因子表達(dá)，以及促進(jìn)ECM蛋白的合成和減少ECM的降解，使ECM增多和異常沉積也發(fā)揮了作用，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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ObjectiveTo investigate the effect of TGF-β1 on expression of inflammatory factors and accumulation of extracellular matrix in rat peritoneal mesothelial cells(RPMCs)．MethodsAfter growth arrest and synchronization for 24 h,primarily cultured RPMCs were treated with TGF-β1(10ng/ml)for 0,4,12,24 and 48h．The mRNA and protein expression levels of MCP-1, IL-6,CollagenⅠand PAI-1 were measured by RT-PCR and ELISA/Western blotting,respectively．ResultsCompared to 0h group, the expression of MCP-1,IL-6 and PAI-1 mRNA after 6h stimulation and the expression of CollagenⅠmRNA after 12h stimulation was up-regulated (P＜0．05)．TGF-β1 also significantly up-regulated the expression of MCP-1,IL-6 and PAI-1 proteins after 4h and 12h stimulation,and up-regulated expression of CollagenⅠprotein after 24h stimulation(P＜0．05)．TGF-β1 up-regulated mRNA and protein expression levels of MCP-1,IL-6,CollagenⅠand PAI-1 in a time-dependent manner in RPMCs．ConclusionTGF-β1 induced inflammatory factors upregulation and accumulation of extracellular matrix in RPMCs,which may be associated with peritoneal fibrosis．

Peritoneal mesothelial cells Inflammatory factors Extracellular matrix TGF-β1

2014-08-20）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2101241)

310003 杭州，浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科

張?chǎng)珽-mail：zhangwenta@hotmail.com