孫澤威，仲慶振，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春130118）

急性熱應(yīng)激鵝心和肝和肺及腎臟組織中HSP70 mRNA及蛋白的表達

孫澤威，仲慶振，婁玉杰*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春130118）

選取1日齡健康雁鵝60只，隨機分為6組，單籠飼養(yǎng)于環(huán)控倉內(nèi)。6周齡時，A組置于（22±1）℃作為對照，B、C、D、E、F組分別施于2、4、6、8 h和10 h （40±1）℃的急性熱應(yīng)激處理，處理后立即剖殺，取心、肝、肺和腎臟組織，實時熒光定量PCR測定HSP70mRNA表達量，免疫組織化學(xué)方法測定HSP70表達量。結(jié)果表明：急性熱應(yīng)激處理可顯著提高各組織中HSP70 mRNA及HSP70蛋白的表達水平，但不同組織出現(xiàn)顯著變化的時間以及隨熱應(yīng)激時間延長的變化規(guī)律存在差異。心臟組織HSP70mRNA和蛋白表達量均在熱應(yīng)激2 h后出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），熱應(yīng)激4 h后達到最高值，8 h后降至對照組水平，遵循二次曲線回歸模式；肝臟熱應(yīng)激4～10 h間HSP70及其mRNA均顯著高于對照組（P＜0.05），但未表現(xiàn)出顯著的線性與二次回歸趨勢；肺臟HSP70mRNA表達水平在熱應(yīng)激2～10 h間顯著高于對照組（P＜0.05），HSP70則從熱應(yīng)激4 h起才顯著升高，但二者隨熱應(yīng)激時間延長均呈顯著的線性升高規(guī)律；與肺相似，腎臟HSP70及其mRNA表達量隨熱應(yīng)激時間的變化趨勢也遵循線性回歸模式，兩者均在熱應(yīng)激4～10 h顯著升高（P＜0.05）。

熱應(yīng)激；熱休克蛋白70；鵝

應(yīng)激是機體在基因水平上發(fā)動的全面抗脅迫過程,應(yīng)激條件下機體能迅速激活一些基因,表達出一系列分子量不同的熱休克蛋白(HSPs)參與機體的應(yīng)激反應(yīng)［1-2］。HSP70是熱應(yīng)激蛋白中最重要的家族,具有普遍性、高度保守性及應(yīng)激性,并通過分子伴侶作用、抗氧化作用、協(xié)同免疫作用和抗細胞凋亡作用抵抗應(yīng)激危害［3］。在家禽熱應(yīng)激方面,嚴建燕［4］、孫培明［5］、雷蕾［6］等分別針對不同熱應(yīng)激溫度和時間條件下,雞主要器宮組織中HSP60、HSP70、HSP90及其mRNA的表達進行了比較系統(tǒng)的研究,進一步證實了熱休克蛋白的應(yīng)激保護作用。但對于水禽熱應(yīng)激的研究,國內(nèi)外均剛剛起步,僅吳曉平等［7］和仲慶振［8］就鵝的熱應(yīng)激方面開展了一些工作。仲慶振［8］研究發(fā)現(xiàn),急性熱應(yīng)激可在一定程度上損傷鵝心、肝、脾、肺、腎等器宮組織,且不同器宮組織的損傷程度存在顯著差異。但伴隨著鵝熱應(yīng)激損傷的發(fā)生,熱休克蛋白表達的響應(yīng)情況尚有待于進一步揭示。

隨著飼養(yǎng)方式由放養(yǎng)型向集約化、高密度飼養(yǎng)的轉(zhuǎn)變,原本很少出現(xiàn)熱應(yīng)激的水禽也受到了熱應(yīng)激的威脅,而且水禽與陸生家禽存在著明顯的生態(tài)適應(yīng)性差異,揭示水禽器宮組織中熱休克蛋白隨熱應(yīng)激強度變化的表達規(guī)律,對于深入探討家禽的熱應(yīng)激耐受機制具有重要意義。本研究以鵝為研究對象,對急性熱應(yīng)激條件下鵝主要組織中HSP70 mRNA及蛋白的表達,尤其是其隨熱應(yīng)激強度的變化規(guī)律進行研究,以期為深入探討HSP70在家禽抵抗應(yīng)激性損傷中的生理功能和作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計選取1日齡健康雁鵝60只,隨機分成6組,每組10個重復(fù),每個重復(fù)1只,單籠飼養(yǎng)在環(huán)控倉內(nèi),自由采食及飲水。隨著日齡的增長,逐漸將環(huán)境溫度下調(diào)至(22±1)℃。待飼養(yǎng)至8周齡時,A組環(huán)境溫度仍設(shè)置(22±1)℃,B、C、D、E、F組鵝分別施于2、4、6、8 h和10 h(40±1)℃(相對濕度65%)的高溫處理,各組處理均在16∶00結(jié)束。

1.2 樣品采集試驗處理結(jié)束后,試驗鵝全部屠宰,取心、肝、肺和腎臟組織樣本,一部分固定于4%多聚甲醛溶液中以備免疫組織化學(xué)檢測；另一部分迅速投入液氮速凍后置-80℃保存待測。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 鵝體組織中HSP70mRNA定量檢測總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄：利用Trizol試劑盒提取總RNA,凝膠電泳以及核酸蛋白儀鑒定其純度和完整性,OD260/OD280為1.8～2.0,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(寶生物工程有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20℃保存。

引物設(shè)計：根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝HSP70基因序列(序列號：EU680475)和GAPDH基因序列(序列號：DQ821717),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兩對引物,HSP70 F：5′-GGAGACAAGTCCGAGAAT-3′, HSP70R：5′-GGAGGGATGCCTGTTAGA-3′；GAPDHF：5′-GGTGGTGCTAAGCGTGTCAT-3′,GAPDH-R：5′-CCCTCCACAATGCCAAAGTT-3′。所有引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

實時熒光定量PCR檢測：熒光實時定量PCR在美國產(chǎn)ABI7000熒光定量分析儀上進行。PCR反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)液配比為cDNA模板1.0 μL,上、下游引物各0.4 μL,Premix Ex Taq10 μL,滅菌蒸餾水7.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s,95℃5 s,60℃30 s,共40個循環(huán)。所有樣品檢測均設(shè)1個平行樣和1個無模板的阱性對照以排除假陽性結(jié)果。獲得HSP70標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-3.5846Log(X)+27.2794,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9693；內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-3.5086Log(X)+23.8604,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9679?！鰿t(CtHSP70-CtGAPDH)與模板倍比稀釋濃度的線性方程為Y=0.018X+3.406,斜率接近0,說明HSP70 mRNA和內(nèi)參GAPDH具有相似的擴增效率,可以應(yīng)用2-△△Ct法對測定結(jié)果進行計算分析。

1.3.2 鵝體組織中HSP70含量檢測組織切片的制備：按常規(guī)組織學(xué)方法,將多聚甲醛固定的心臟組織樣修樣,經(jīng)過水洗、脫水和透明處理后進行石蠟包埋,制成臘塊,5 μm切片,H.E染色,光鏡下觀察并拍照。

免疫組織化學(xué)染色：組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后置于pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中修復(fù)5 min；經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min；5%山羊血清封閉10 min；一抗(HSP 70單克隆抗體) 37℃孵育1 h；生物素標(biāo)記的二抗孵育10 min；鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液孵育10 min；DAB顯色3 min；蘇木精復(fù)染8 min；脫水、透明、中性樹膠封固,光鏡下觀察并拍照。HSP70陽性染色呈棕黃色。

圖像采集與分析：用Olympus攝影顯微鏡進行圖像采集,用Image-pro Plus5.02進行圖像分析。每個觀測樣本選取5個視野進行照相,計算其平均數(shù),為該張切片的測試值。以積累光密度值(IOD)表示HSP70的相對含量。

其中,αi每塊免疫組化染色陽性區(qū)域的面積；βi該陽性區(qū)域的光密度；n 陽性區(qū)域的數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件的One-Way程序,針對不同器宮HSP70及其mRNA隨熱應(yīng)激處理時間延續(xù)的表達規(guī)律,遵循Yij=Ai+eij模型(i代表熱應(yīng)激處理時間,j代表重復(fù))進行方差分析(LSD)和趨勢分析,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組織HSP70mRNA表達量變化如表1所示,心臟中HSP70 mRNA表達水平隨熱應(yīng)激時間的延長,遵循二次曲線回歸模式(P=0.004),HSP70 mRNA表達水平從熱應(yīng)激2 h開始顯著升高(P＜0.05),4 h熱應(yīng)激處理后達到最高水平,但隨著熱應(yīng)激時間的延長,熱應(yīng)激8、10 h后HSP70 mRNA表達水平并未再持續(xù)升高,反而降低至對照組水平；肝臟的HSP70 mRNA水平在熱應(yīng)激4 h后達到峰值(P＜0.05),此后的6、8、10 h HSP70 mRNA水平雖絕對值有所下降但仍顯著高于對照組(P＜0.05),未表現(xiàn)出顯著的線性回歸趨勢(P=0.054)；鵝肺臟組織HSP70 mRNA水平從熱應(yīng)激2 h開始,隨熱應(yīng)激時間的延長呈現(xiàn)顯著的線性升高趨勢(P=0.004)；腎臟HSP70 mRNA表達水平與肺臟相似,從熱應(yīng)激4 h開始隨熱應(yīng)激時間的延長線性升高(P=0.027)。

2.2 各組織HSP70表達量變化如表2所示,熱應(yīng)激處理期間,心肌HSP70含量從熱應(yīng)激2 h后便顯著升高,并于熱應(yīng)激4 h后達到峰值,此后在熱應(yīng)激8 h和10 h恢復(fù)到熱應(yīng)激前水平,隨熱應(yīng)激時間延長的變化規(guī)律遵循二次曲線回歸模式(P=0.006)；肝臟中HSP70的含量隨熱應(yīng)激時間的變化趨勢與心肌組織相似,也在熱應(yīng)激4 h時顯著升高至峰值,但此后各時間點HSP水平雖逐漸下降,但仍顯著高于對照組；肺臟組織中HSP70水平隨熱應(yīng)激時間延長呈線性升高趨勢,峰值出現(xiàn)在6 h；腎臟與肺臟相似,HSP70含量隨熱應(yīng)激時間的變化趨勢也遵循線性回歸模式(P=0.02),熱應(yīng)激4 h后HSP70水平達到峰值,4、6 h和8 h間無顯著差異,熱應(yīng)激10 h后顯著下降,但仍高于熱應(yīng)激前水平。

表1 熱應(yīng)激鵝各組織中HSP70mRNA相對表達量

表2 急性熱應(yīng)激對鵝各器官組織中HSP70表達的影響(積累光密度)

3 討論

3.1 急性熱應(yīng)激對鵝各組織中HSP70mRNA表達量的影響本試驗的熱應(yīng)激處理使雁鵝心、肝、肺和腎臟中HSP70 mRNA的表達水平均出現(xiàn)了不同程度的升高,鵝各組織中HSP70 mRNA水平高表達出現(xiàn)和維持的時間存在一定差異。心臟和肺臟組織對熱應(yīng)激的敏感性較高,HSP70 mRNA表達水平在熱應(yīng)激2 h后即出現(xiàn)了顯著升高,而肝臟和腎臟HSP70 mRNA表達水平則在熱應(yīng)激4 h后出現(xiàn)高表達。在對熱應(yīng)激條件下肉雞HSP 60mRNA、HSP70 mRNA、HSP90 mRNA表達情況的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象,熱應(yīng)激條件下不同組織HSPs mRNA水平的變化具有時間特異性［4-6］。

鵝組織中HSP70 mRNA隨熱應(yīng)激時間的延長所表現(xiàn)出的變化規(guī)律也存在著一定的組織差異?？傮w來看,隨著熱應(yīng)激時間的延長,組織中HSP70 mRNA水平均呈現(xiàn)波動性變化,出現(xiàn)高峰值后會有一個表達水平下降的過程。HSPs的轉(zhuǎn)錄是由HSFs介導(dǎo)的［9］,在正常生理狀態(tài)下HSFs位于胞漿內(nèi),處于一種無活性狀態(tài)［10］。但在熱應(yīng)激條件下,HSF與HSE結(jié)合并活化HSPs基因轉(zhuǎn)錄的反式調(diào)控因子以控制HSPs的表達［11］。隨著HSPs合成的增加,新生的HSPs又與HSF結(jié)合,反饋抑制HSPs的進一步合成［12］。本試驗所檢測到的這種HSP 70 mRNA水平的波動性變化完全符合這種負反饋調(diào)節(jié)機制。

3.2 急性熱應(yīng)激對鵝各組織中HSP70表達的影響HSP70作為機體內(nèi)的一種重要的非特異性細胞保護蛋白,在應(yīng)激狀況下可以增強機體的應(yīng)激耐受性,提高細胞生存率。當(dāng)組織受到熱應(yīng)激損傷時,組織中的HSP70的含量升高以保護組織細胞［13］。本試驗所測定各組織中的HSP70水平在熱應(yīng)激的刺激下均顯著升高。心臟、肺臟和肝臟是熱應(yīng)激容易損傷的3種組織,熱應(yīng)激處理過程中HSP70的高表達說明HSP70在這3種組織的抗應(yīng)激中發(fā)揮著重要保護作用。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)鵝熱應(yīng)激過程中HSP70變化的相關(guān)報道,但與國內(nèi)外針對肉雞［14］、鼠［15］動物的研究結(jié)果存在較大差異,仍有待于進一步研究證實。

本試驗所測定各組織中HSP70水平開始出現(xiàn)顯著升高的時間不同。肝臟、肺臟和腎臟中HSP70均是在熱應(yīng)激持續(xù)4 h后才出現(xiàn)顯著升高,而心臟在熱應(yīng)激2 h后其HSP70水平即已顯著高于對照組。這在一定程度上說明,上述不同組織中HSP70水平對熱應(yīng)激的敏感性存在差異。石嬌等［16］對急性熱應(yīng)激肉雞組織中HSP70進行了定位。研究提出,HSP70的表達與其所在組織的血液供應(yīng)有關(guān),熱應(yīng)激時心肌活動增強,心肌收縮加速,心臟血流量大,細胞中會合成大量HSP70等熱應(yīng)激蛋白以抵抗急性熱應(yīng)激對肌絲中肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的破壞,并助其恢復(fù)；肝臟中央靜脈周匣血液供應(yīng)豐富,因此肝臟中HSP70的表達也首先出現(xiàn)在肝中央靜脈周匣,并且其反應(yīng)比肝小葉其他部位要強。本試驗也發(fā)現(xiàn),心臟中HSP70對熱應(yīng)激的敏感性要高于其他器宮組織。隨著熱應(yīng)激時間的延長,HSP70的表達并未表現(xiàn)出線性增長的趨勢。熱應(yīng)激2 h后心臟組織中HSP70開始顯著升高,4 h后顯著高于2 h的水平,此后開始下降,直到熱應(yīng)激8 h和10 h后下降到了對照組水平。由此可見,心肌中HSP70水平隨熱應(yīng)激時間的延長呈現(xiàn)波動性變化,這與嚴建燕［4］對熱應(yīng)激肉雞HSP60研究結(jié)果相似。其他各器宮組織中HSP70隨熱應(yīng)激時間延長的變化規(guī)律與也與心臟相似。

3.3 HSP70mRNA及蛋白在鵝體主要組織中表達的關(guān)系本研究發(fā)現(xiàn),鵝各組織中HSP70水平隨熱應(yīng)激時間延長的變化趨勢與HSP70mRNA表達的變化趨勢幾乎完全相同。當(dāng)組織中HSP70mRNA高表達時,該組織中HSP70含量亦會隨之升高,這與雷蕾［6］對熱應(yīng)激肉雞HSP90及其mRNA的表達規(guī)律的研究結(jié)果相似。熱休克蛋白的表達調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平,HSP70翻譯水平的調(diào)控主要是由HSP70基因及其mRNA的特性所決定的。HSP70基因沒有內(nèi)含子,這樣細胞一旦啟動轉(zhuǎn)錄就能產(chǎn)生成熟的mRNA,致使HSP70大量、快速表達。此外,熱應(yīng)激時,其他正常蛋白的翻譯受到抑制,從而減少了與HSP70 mRNA翻譯的競爭,也是HSP70大量表達的原因之一［17］。但隨著熱應(yīng)激時間的延長也出現(xiàn)了HSP70mRNA表達先降低至對照組水平而HSP70含量仍顯著高于對照組的現(xiàn)象。這可能與HSP的負反饋調(diào)節(jié)有關(guān),即高水平HSP和HSF結(jié)合時會抑制HSF活性,從而減少HSF和HSE的特異性結(jié)合,控制熱休克基因的轉(zhuǎn)錄。

4 小結(jié)

本試驗的急性熱應(yīng)激處理使鵝不同組織中HSP70 mRNA及HSP70水平均出現(xiàn)不同程度的升高。各組織中HSP70 mRNA及HSP70表達量的變化存在時間特異性,且隨熱應(yīng)激時間的延長呈現(xiàn)出不同的回歸模式,相比較而言HSP70水平的變化更加平穩(wěn),且在一些組織中的變化會滯后于HSP70 mRNA表達的變化。

［1］Akbarian A,Golian A,Gilani A,et al.Effect of feeding citrus peel extracts on growth performance,serum components,and intestinal morphology of broilers exposed to high ambient temperature during the finisher phase［J］.Livest Sci,2013,157（2-3）:490-497.

［2］付旭彬,孫培明,李玉保,等.肉雞組織臟器的急性熱應(yīng)激損傷及HSP90的表達［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2004,27（3）:85-88.

［3］張旭輝.熱休克蛋白70與熱耐受的機制［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2001,19（1）:73-75.

［4］嚴建燕.肉雞組織的熱應(yīng)激損傷和熱休克蛋白60的表達變化［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

［5］孫培明.肉雞熱應(yīng)激損傷與熱休克蛋白70表達的研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

［6］雷蕾.肉雞組織的熱應(yīng)激損傷與Hsp90水平及其mRNA表達的變化［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

［7］吳曉平,王寶維,張旭暉,等.鵝熱休克蛋白70的表達提純與病毒復(fù)合物形成的研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40（9）: 2084-2090.

［8］仲慶振.不同品種鵝急性熱應(yīng)激反應(yīng)極其相關(guān)機理的研究［D］.長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

［9］Morimoto R I,Santoro M G.Stress-inducible responses and heat shock proteins:new pharmacologic targets for cytoprotection［J］. Nat Biotech,1998,16（9）:833-838.

［10］Voellmy R.Dominant-positive and dominant-negative heat shock factors［J］.Methods,2005,（35）:199-207.

［11］Zou J,Guo Y,Guettouche T,et al.Repression of heat shock transcription factor HSF1 activation by HSP90（HSP90 complex）that forms a stress-sensitive complex with HSF1［J］.Cell,1998, 94（4）:471-480.

［12］Zhu J,Katz R,Quyyumi A A.Association of serum antibodies to Heat-Shock protein 65 with coronary cacification levels.suggestion of Pathogen-Triggered autoimmunity in early atherosclerosis［J］. ACC Current J Rev,2004,13（4）:29.

［13］Gabai V L,Meriin A B,Mosser D D,et al.HSP70 prevents activation of stress kinase-A novel pathway of cellular thermotolerance［J］.Biol Chem,1997,272（29）:18033-18037.

［14］Leandro N S,Gonzales E,Ferro J A,et al.Expression of heat shock protein in broiler embryo tissues after acute cold or heat stress［J］.Mol Reprod Dev,2004,67（2）:172-177.

［15］Wong C G,Bonakdar M,Mautz W J,et al.Chronic inhalation exposure to ozone and nitric acid elevates stress-inducible heat shock protein 70 in the rat lung［J］.Toxicology,1996,107（2）: 111-119.

［16］石嬌,高明,趙金蘭,等.急性熱應(yīng)激條件下肉雞組織器官中HSP70表達定位［J］.動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué),2004,21（11）:5-7.

［17］吳炳義,宋亮年,徐仁寶.背部燙傷大鼠腦及肝臟熱休克蛋白70（hsp70）mRNA的誘導(dǎo)［J］.生理學(xué)報,1995,47（4）:412-416.

S835.2

A

0258-7033（2015）09-0052-04

2014-07-02；

2015-01-10

國家自然科學(xué)基金項目（31372331）；吉林省現(xiàn)代家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（201229）

孫澤威（1974-），男，吉林長春人，博士，副教授，主要從事動物營養(yǎng)學(xué)研究，E-mail：sunzewei@jlau.edu.cn

*通訊作者：婁玉杰，E-mail：lyjjlau@163.com