趙旺生，羅軍，邱思源，王紫騫

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，陜西楊凌712100）

奶山羊催乳素受體基因CDS區(qū)的克隆和序列分析與腺病毒干擾載體的構(gòu)建

趙旺生，羅軍?，邱思源，王紫騫

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，陜西楊凌712100）

本文旨在克隆奶山羊催乳素受體（PrlR）基因CDS序列，在此基礎上構(gòu)建針對奶山羊PrlR的腺病毒干擾載體，為研究PrlR在奶山羊乳腺乳脂合成代謝中的功能與調(diào)控作用提供有效的RNA干擾工具。首先從西農(nóng)薩能羊乳腺組織RNA中擴增得到完整CDS區(qū)序列，其CDS長為1 746 bp，包含581個氨基酸序列，GenBank登錄號為JF966783；測序后進行序列分析和功能預測，奶山羊PrlR基因CDS區(qū)與其他反芻動物相應序列具有較高的同源性，其跨膜區(qū)為第236～258位氨基酸；然后根據(jù)測序得到的CDS序列，在線設計合成奶山羊PrlR的sh RNA序列并成功構(gòu)建重組干擾腺病毒載體；將這些載體在293細胞系中進行包裝和擴繁，最終獲取高滴度的腺毒，使用TCID50法檢測病毒滴度為5.19×108PFU/mL。

催乳素受體；克??；腺病毒；shRNA；奶山羊

山羊奶中乳蛋白、乳脂含量高，且具有脂肪酸不飽和度高、短中鏈脂肪酸含量高等特點，這些特點使得山羊奶成為具有優(yōu)良營養(yǎng)價值和獨特風味的動物食品［1-2］。研究山羊乳腺乳脂代謝尤其是乳脂生物合成的調(diào)控機制，對進一步了解乳腺泌乳過程的調(diào)控網(wǎng)絡，研究利用乳腺生物反應器都有重要意義。研究表明，催乳素受體在乳脂合成代謝中有重要的調(diào)控作用［3-5］。催乳素受體（prolactin receptor，PrlR）是單次跨膜蛋白，屬于Ⅰ類細胞因子超家族。乳腺細胞膜表面的PrlR與其配體結(jié)合后，可開啟細胞內(nèi)信號通路，與泌乳相關的下游基因作用，從而增加乳蛋白和乳脂含量，最終促進泌乳。PrlR可通過Ark-1等轉(zhuǎn)錄因子信號通路，調(diào)控與乳脂合成相關基因的表達［6-8］。自從PrlR第1次被分離克隆后［9］，多個物種上的PrlR基因的mRNA序列已經(jīng)得到［10-13］。盡管蛋白的基本結(jié)構(gòu)相同，其核苷酸和氨基酸序列在不同物種的長度和組成都有差異，其在染色體上的定位也各不相同。到目前為止，尚無完整的山羊PrlR基因CDS序列，對研究其功能和調(diào)控機制造成了一定的障礙。本研究以乳腺泌乳調(diào)控中起主要作用的PrlR作為研究對象，從泌乳盛期乳腺組織中克隆山羊PrlR基因CDS區(qū)序列，對其進行生物信息學分析，并構(gòu)建腺病毒干擾載體，為進一步的功能研究提供理論基礎和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品實驗羊來自西北農(nóng)林科技大學薩能羊原種場，選取健康的純種西農(nóng)薩能羊（第2胎，泌乳52 d），手術法采集乳腺組織樣。

1.1.2 主要試劑RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒、TOP10感受態(tài)細胞和DNA凝膠純化回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；3′RACE試劑盒購自大連寶生物（TaKaRa）有限公司；5′RACE試劑盒、TRIZOL購自Invitrogen公司；DNA質(zhì)粒提取和凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克（BioDev）公司；T4連接酶和pGM-T Easy載體購自Promega公司；PCR引物由上海捷瑞有限公司合成，shRNA模板由上海生工公司合成；穿梭載體pENTR/CMV-GFP/ U6質(zhì)粒及腺病毒骨架載體pAd/PL-DEST質(zhì)粒由深圳大學茍德明教授惠贈；293細胞系由本實驗室傳代保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與合成根據(jù)NCBI已公布的綿羊PrlR基因CDS序列和牛PrlR基因cDNA序列設計合成PrlR克隆引物PrlR-U1和PrlR-L1，最終得到PCR擴增產(chǎn)物1 463 bp，擴增PrlR上、下游CDS區(qū)序列所用引物參照試劑盒說明書進行設計。

根據(jù)克隆得到的西農(nóng)薩能羊PrlR序列，利用siRNA在線設計程序（http：//jura.wi.mit.edu/bioc/ siRNAext/home.php）設計PrlR的siRNA序列。通過序列比對分析，篩選針對奶山羊長型PrlR mRNA胞內(nèi)區(qū)的siRNA。在siRNA基礎上，添加發(fā)夾環(huán)序列間隔（GAGTACTG），BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，和TTTTTT終止信號，即得到編碼目的基因shRNA的單鏈DNA寡核苷酸正、反義鏈模板。

1.2.2 奶山羊PrlR基因CDS克隆采用Trizol法提取西農(nóng)薩能羊乳腺組織總RNA。利用引物PrlR-U1和PrlR-L1擴增得到奶山羊PrlR基因的部分CDS區(qū)片段。利用引物PrlR-3I1和PrlR-5I3進行RACE PCR擴增得到奶山羊PrlR基因的上、游CDS區(qū)片段。將目的片段切膠回收純化，連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10進行藍白斑篩選，挑取陽性單克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后進行測序。

1.2.3 生物信息學分析采用NCBI中的nucleotide blast程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對測序獲得的PrlR基因核苷酸序列進行同源性比對和分析；利用BioXM 2.6軟件對PrlR基因的蛋白質(zhì)分子量及等電點進行預測以及不同物種間氨基酸序列的比對；利用ExPASy網(wǎng)站的ProtScale程序（http：//web. expasy.org/protscale/）對PrlR的氨基酸序列進行疏水性預測；通過CBS Prediction Servers（http：//www.cbs. dtu.dk/services/）中的SignalP和TMHMM程序分別對PrlR的信號肽結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)域進行分析。

1.2.4 重組腺病毒載體的構(gòu)建將合成的單鏈shRNA稀釋后進行退火，得到雙鏈寡核苷酸序列，稀釋到工作濃度后與BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的穿梭載體pENTR/CMV-GFP/U6進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10，卡那霉素抗性篩選后，提取陽性質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序。將帶有shRNA序列的穿梭載體與骨架載體pAd/PL-DEST進行同源重組，酶切鑒定正確后測序。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染HEK 293細胞。

1.2.5 腺病毒的包裝與擴增重組腺病毒載體經(jīng)PacⅠ酶切線性化，純化回收后用于轉(zhuǎn)染生長融合度為80%～90%的293細胞系。在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的多少，以顯示腺病毒的包裝與擴繁程度。當約50%細胞從培養(yǎng)瓶底部脫落時即可收毒。重復“感染-凍融-收集”，大量擴增重組腺病毒。

1.2.6 腺病毒滴度的測定采用TCID50法（50%組織培養(yǎng)感染劑量法）測定腺病毒滴度。

表1 特異引物的名稱及序列

2 結(jié)果

2.1 奶山羊PrlR基因CDS克隆經(jīng)比對拼接，得到奶山羊長型PrlR基因CDS區(qū)序列，全長1 746 bp，編碼581個氨基酸，GenBank登錄號JF966783。

2.1.1 奶山羊PrlR基因CDS區(qū)的同源性分析BLAST同源性比對結(jié)果顯示奶山羊（JF966783）與牛（NM_001039726）、綿羊（AF041257.1）、人（AK313270）和小鼠（NM_011169）PrlR基因CDS區(qū)序列的核苷酸同源性分別為95%、97%、81%和80%；氨基酸序列同源性分別為91%、94%、67%和62%，見圖4。

圖1 PrlR基因CDS區(qū)PCR產(chǎn)物

圖2 PrlR基因3′RACE PCR產(chǎn)物

圖3 PrlR基因5′RACE PCR產(chǎn)物

圖4 山羊、牛、綿羊、人和小鼠PrlR氨基酸序列同源性比對

2.1.2 奶山羊長型PrlR的跨膜結(jié)構(gòu)預測奶山羊PrlR氨基酸序列前24位為信號肽（見圖5）。Tmpred跨膜結(jié)構(gòu)預測共發(fā)現(xiàn)4個可能的跨膜結(jié)構(gòu)，N端在膜外側(cè)；其中分值最高的是從氨基酸236～258位，方向為由外向內(nèi)（見圖6）。肽鏈N端以強疏水性氨基酸開始，大約在230～260位氨基酸處存在1個強疏水性區(qū)域，與預測的最大可能跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域重合（圖7）。三維結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)奶山羊長型PrlR的立體構(gòu)象是由一個α-螺旋跨膜區(qū)連接的L形蛋白，胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)各由反向平行的β折疊片組成，包含一些轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲（圖8）。

2.1.3 奶山羊PrlR的功能預測翻譯后修飾預測奶山羊長型PrlR上存在9個可能的酪氨酸磷酸化位點，其中4個在胞內(nèi)區(qū)，是啟動STAT5信號傳遞的磷酸化位點。在N端胞外區(qū)有2個潛在的纖連蛋白Ⅲ型功能域（28～112，127～215）；蛋白上存在4個潛在的酪氨酸激酶磷酸化位點，5個蛋白激酶C磷酸化位點，1個cAmp/cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，4個糖基化位點和10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。顯示了此蛋白具有活躍的生物學功能。

奶山羊PrlR是一個不穩(wěn)定蛋白，化學式為C2949H4535N739O878S25，分子量65 u，理論等電點為5.20。

2.2 腺病毒干擾載體的構(gòu)建

2.2.1 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構(gòu)建測序結(jié)果表明，載體pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA中插入的序列與所設計的shRNA原序列完全一致，證明載體構(gòu)建成功（圖9）。

2.2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)過氨芐青霉素/氯霉素雙重篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒進行電泳檢測，見圖10。進一步用ScaⅠ酶切后，以0.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖11。測序結(jié)果顯示，重組序列與pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA中的shRNA序列完全一致，證明重組腺病毒載體構(gòu)建成功。

圖5 山羊PrlR蛋白信號肽預測

圖6 山羊PrlR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

圖7 山羊長型PrlR蛋白疏水結(jié)構(gòu)預測

圖8 山羊長型PrlR的三級結(jié)構(gòu)預測

圖9 重組腺病毒的包裝與擴增(×100)

圖10 重組腺病毒的包裝與擴增(×100)

圖11 重組腺病毒的包裝與擴增(×100)

2.2.3 腺病毒的包裝、擴增及滴度測定pAd/PLDEST/CMV-GFP/U6-shRNA重組質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ線性化后，轉(zhuǎn)染293細胞系。轉(zhuǎn)染12 d后GFP大量表達，收集病毒，得到第1代病毒原液。以病毒上清反復感染細胞3次后，獲得高滴度的腺病毒，經(jīng)TCID50法計算滴度為5.19×108U/mL（圖10）。

圖12 重組腺病毒的包裝與擴增(×100)

3 討論

3.1 奶山羊PrlR長型CDS的同源性分析本研究首次克隆得到了山羊PrlR基因的CDS區(qū)全長序列，共1 746 bp，編碼581個氨基酸殘基。山羊PrlR基因與綿羊和牛的PrlR氨基酸和核苷酸序列長度一樣，同源性很高（＞95%）；與人和小鼠長型PrlR的序列同源性較差。這顯示PrlR基因的同源性與物種進化親緣關系相關。山羊長型PrlR與綿羊的序列相似度最高，此前的報道顯示，綿羊催乳素能夠用于山羊的體外研究［14］，這2個物種間序列的高相似性間接提供了理論依據(jù)，因為相似的受體能夠結(jié)合相似的配體。整體來看，PrlR基因不同物種間的相似性可以用于預測物種進化的根據(jù)。奶山羊長型PrlR上存在9個可能的酪氨酸磷酸化位點，這些位點可能與JAK-STAT5和AKT通路的信號轉(zhuǎn)導通路的激活有關。

3.2 奶山羊長型PrlR的跨膜結(jié)構(gòu)SignalP 3.0 Server分析山羊PrlR氨基酸序列N端有信號肽結(jié)構(gòu)存在的可能性為0.924，長度為24個氨基酸。TMpred跨膜結(jié)構(gòu)預測奶山羊PrlR基因的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，PrlR基因有4個可能的跨膜區(qū)域，分別位于第8～12、98～119、236～258和433～454位氨基酸之間，其中氨基酸236～258位的跨膜結(jié)構(gòu)分值高于另外3個結(jié)構(gòu)的得分總和，其長度包含23個氨基酸序列，跨膜方向從膜外到膜內(nèi)，這與已知的PrlR結(jié)構(gòu)特點是相符的，初步判斷此處為奶山羊長型PrlR蛋白的跨膜區(qū)。與傅澤紅等［15］在人，牛和小鼠上的報道一致。序列分析表明，此段氨基酸序列與牛和綿羊的相應序列完全一致，保守性極高。相同區(qū)段有較強的疏水性；3級結(jié)構(gòu)預測此處為一個α-螺旋。這些結(jié)果符合此處為跨膜區(qū)的判斷。另外，在這段區(qū)域的上游緊鄰的氨基酸第215～219位，發(fā)現(xiàn)了催乳素受體胞外域近膜處的特征性“WS結(jié)構(gòu)”（WSEWS）［4］，進一步驗證了此處為蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。據(jù)此得出奶山羊PrlR的ECD長235個氨基酸，ICD長323個氨基酸。同時PrlR的3級結(jié)構(gòu)的膜外區(qū)有7條β折疊股組成一個三明治結(jié)構(gòu)，其他為轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲，與在人上關于PrlR的3級結(jié)構(gòu)的報道一致［16］。

3.3 shRNA的設計小發(fā)夾RNA編碼序列的設計，是影響RNA干擾效果的前提條件。本研究利用NCBI的在線BLAST進行初篩，得到了針對PrlR基因的4對shRNA，分別在奶山羊PrlR基因編碼區(qū)起始密碼子（ATG）后不同范圍（393、70、860、1156）的19 bp序列。通過對綿羊和牛的長短型PrlR的CDS序列發(fā)現(xiàn)，長型受體比短型受體多一個胞內(nèi)區(qū)。因此本研究選擇位于胞內(nèi)區(qū)的shRNA-1106，用于構(gòu)建腺病毒載體以保證其能特異性地位于長型PrlR基因的CDS區(qū)，從而避免對其他類型PrlR的作用。

4 結(jié)論

奶山羊PrlR基因CDS區(qū)全長1746 bp，編碼581個氨基酸殘基，與反芻動物相應序列的同源性較高。奶山羊PrlR基因為單次跨膜蛋白，跨膜區(qū)域在236～258個氨基酸，含有催乳素受體蛋白的典型特征和多個潛在的功能位點。

本研究成功構(gòu)建了奶山羊PrlR基因的介導shRNA的腺病毒載體，然后轉(zhuǎn)染293細胞系進行腺病毒的包裝和擴繁，最終獲得了高滴度的腺病毒原液，從而為下一步在奶山羊乳腺細胞上研究PrlR基因?qū)θ橹恼{(diào)控提供基礎。

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Cloning，Sequence Analysis of PrlR CDS and Construction of Adenovirus Vector for RNA Interference in Dairy Goat

ZHAO Wang-sheng,LUO Jun*,QIU Si-yuan,WANG Zi-qian
（College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Shanxi Yangling 712100,China）

To provide effective tool to study the role of PrlR in regulation of milk fat synthesis in mammary gland,the present study cloned the coding regions（CDS）of PrlR from mammary gland of Xinong Saanen goat and constructed RNA interfering adenovirus vectors targeting goat PrlR upon CDS sequence.First,complete CDS sequence was amplified from extracted RNA in mammary gland of Xinong Saanen goat and PrlR CDS（GenBank No.JF966783）is 1746 bp in length,coding 581 amino acid residues；Sequence analysis and functional prediction was performed after sequencing and found there was high homologies among goats and some other ruminants and the transmembrane region of PrlR locates at 236～258 amino acid residues；Then,shRNA sequences of PrlR gene was designed online and recombinant adenovirus vectors carrying shRNA targeting goat PrlR was successfully constructed according to the CDS sequences from sequencing；Finally,these adenovirus vectors were packaged and amplified in 293 cell line and hightitered adenovirus（5.19×108 PFU/mL）was obtained after multiple infection with TCID50 method.

dairy goat；PrlR；cloning；adenovirus；shRNA

S827.2

A

0258-7033（2015）09-0056-06

2014-05-24；

2014-11-12

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08009-051B）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201103038）

趙旺生（1983-），男，河南焦作人，博士研究生，主要從事奶山羊乳脂代謝相關研究，E-mail：genetics@nwsuaf.edu.cn

*通訊作者：羅軍，E-mail：luojun1@yahoo.com