兩種檢測(cè)方法對(duì)牛環(huán)形泰勒蟲病感染的調(diào)查

何曉東，伊春陽，楊紅霞，郭慶勇*，巴音查汗*
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

為進(jìn)一步了解新疆托克遜縣某地各年齡段牛環(huán)形泰勒蟲病的感染情況，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血液涂片法和PCR檢測(cè)法分別對(duì)隨機(jī)采集的104頭份牛全血進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，并分析了4個(gè)年齡段牛環(huán)形泰勒蟲病的感染情況。結(jié)果表明，104頭份牛全血涂片染色鏡檢的陽性率為51.0%（53/104），PCR方法檢測(cè)陽性率為57.7%（60/104）,PCR的檢測(cè)陽性率高于全血涂片染色結(jié)果；該地四個(gè)年齡段牛，1~2歲齡牛環(huán)形泰勒蟲病的感染率高于其它三個(gè)年齡段，感染率為72.7%（8/11）。

牛環(huán)形泰勒蟲?。粰z測(cè)方法；感染率

修回日期：2015-03-18

牛環(huán)形泰勒蟲病是由攜帶該病原的蜱叮咬和感染牛所致的一種原蟲病[1]。該病以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫脹為特征，常引起牛致死性白細(xì)胞增殖紊亂[2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須通過的動(dòng)物疫病。牛環(huán)形泰勒蟲的傳播媒介為璃眼蜱，在新疆分布較廣，所攜帶的病原感染牛導(dǎo)致泰氏焦蟲病。該病常見、多發(fā)，是每年防控的重要寄生蟲病。王振寶等[3]在2012年建立了該病的PCR診斷方法，對(duì)新疆疫區(qū)的牛進(jìn)行過調(diào)查。有學(xué)者報(bào)道，新疆某些疫區(qū)該病發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率達(dá)60%[4-5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)托克遜縣某地采集的104血樣分別進(jìn)行了全血涂片鏡檢和PCR檢測(cè)，對(duì)兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，并對(duì)不同年齡組的感染率進(jìn)行了分析，初步了解了該地牛環(huán)形泰式焦蟲病的感染現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1樣品來源

2014年5月5日隨機(jī)采自新疆吐魯番地區(qū)托克遜縣夏鄉(xiāng)南湖村的104頭不同年齡段牛，同時(shí)記錄牛只的編號(hào)、年齡。

1.2血液涂片檢查

取已標(biāo)記好的干凈載玻片，用移液槍取適量血液滴在載玻片上，用推片使其形成扇形的薄膜，即為理想涂片。待涂片自然晾干后用甲醇浸潤(rùn)整個(gè)血涂片，用稀釋好的姬姆薩爾染液對(duì)晾干涂片染色2~3 min。染色結(jié)束后，將涂片用蒸餾水沖洗至淡粉色，多余水分自然晾干，置顯微鏡下，用油鏡鏡檢。

1.3 PCR檢測(cè)法

1.3.1 設(shè)計(jì)引物

參考Christine D’Oliveira等[6]報(bào)道設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其中，環(huán)形泰勒蟲的上游引物為5′-GTAACCTTTAAAAACGT-3′；下游引物為：5′-GTTACGAACATGGGTTT-3′。擴(kuò)增的特異性片段長(zhǎng)為721bp。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR擴(kuò)增試劑均購(gòu)自上海生工有限公司。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：總體積25 μL，其中Mix12.5 μL，上、下游引物(umoL/L)各1 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水加8.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃變性5 min,35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94℃，30 s；56℃，45 s；72℃，1 min)，72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4不同年齡段牛感染環(huán)形泰勒蟲情況比較

分別統(tǒng)計(jì)0～6月齡、7～12月齡、1～2歲、3歲以上牛環(huán)形泰勒蟲的感染率情況，通過數(shù)據(jù)對(duì)比了解不同年齡段牛對(duì)環(huán)形泰勒蟲的感染現(xiàn)狀。

2 結(jié)果與分析

2.1血液涂片染色鏡檢

104份血液涂片鏡檢結(jié)果顯示，有53頭牛發(fā)現(xiàn)了圓點(diǎn)狀或戒指狀的蟲體（圖1），即環(huán)形泰勒蟲，感染率為51.0%。

2.2 PCR檢測(cè)

對(duì)提取的104份牛血液DNA樣品進(jìn)行了PCR檢測(cè)，60份呈現(xiàn)陽性，感染率為57.7%，陽性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物為721 bp，與預(yù)期條帶相符（圖2）。

2.3不同檢測(cè)方法及不同年齡段牛感染環(huán)形泰勒蟲情況比較

檢測(cè)結(jié)果顯示，PCR檢測(cè)的感染率為57.7%，血液涂片檢查的感染率51%，表明PCR的檢出率高于血涂片檢出率（表1）。所檢測(cè)的104份樣品中，73份有年齡標(biāo)記。其中，0～6月齡21份、7～12月齡12份、1～2歲11份、3歲以上的樣品29份，其感染率分別為57.1%、66.7%、72.7%、58.6%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1～2歲的牛對(duì)環(huán)形泰勒蟲病的感染率最高，為72.7%（表2）。

表1 牛環(huán)形泰勒蟲PCR檢測(cè)和血液涂片檢查結(jié)果比較

圖1 牛血液圖片檢測(cè)結(jié)果

圖2 部分血液樣品牛環(huán)形泰勒蟲PCR檢測(cè)結(jié)果

表2 不同年齡牛環(huán)形泰勒蟲病的感染情況

3 討論

蜱作為牛環(huán)形泰勒蟲病的傳播媒介，是造成該病流行的主要原因。新疆吐魯番盆地屬暖溫帶干旱荒漠氣候，夏季氣候炎熱，極端最高氣溫為48℃，這為蜱蟲的孳生提供了良好的環(huán)境[7]。沙塔爾·卡哈爾等[8]曾在2013年也對(duì)吐魯番部分疫區(qū)的126頭份疑似病例進(jìn)行了采集檢測(cè)，PCR檢測(cè)的陽性率為51.6%，血涂片染色鏡檢的陽性率為47.6%，兩種方法檢測(cè)的其感染率均低于本次的檢測(cè)結(jié)果，但也顯示PCR檢測(cè)陽性率高于血涂片染色鏡檢。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，PCR檢測(cè)方法較血涂片方法檢出率高，但多數(shù)的基層獸醫(yī)部門由于技術(shù)和設(shè)備的限制，目前仍在使用血液涂片法。血液涂片檢測(cè)在制片染色方面要求較高，鏡檢觀察也需要一定的經(jīng)驗(yàn)，否則容易出現(xiàn)漏診和誤診，降低了該病的檢出率。

通過血液涂片和PCR方法進(jìn)行檢測(cè)顯示，新疆吐魯番托克遜縣夏鄉(xiāng)南湖村牛環(huán)形泰勒蟲病的感染情況不容樂觀。建議該地畜牧獸醫(yī)部門要加強(qiáng)牛環(huán)形泰勒蟲病防控工作。在每年早春季節(jié)要對(duì)轄區(qū)的牛用環(huán)形泰式焦蟲苗進(jìn)行免疫注射；同時(shí)加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)牛戶牛焦蟲病診斷、防治的技術(shù)培訓(xùn)，儲(chǔ)備用于牛焦蟲病治療的藥物制劑，最大限度的降低該病所造成的損失。

[1]簡(jiǎn)子健,馬素貞,孫其喆,等.新疆牛環(huán)形泰勒蟲蟲病的流行病學(xué)調(diào)查[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,(08):1509-1513.

[2]Schnittger L, Katzer F，Biermann R, et al. Characterization of polymorphic Theileria annulata surface protein(TaSP)closely related to PIM of Theileria annulata:Implications for use in diagnostic tests subunit vaccines[J].Mol biochem Parasit,2002,120(2):247-256.

[3]王振寶,劉啟生,哈森,等.牛環(huán)形泰勒蟲蟲病二溫式PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012,33(5):59-63.

[4]米日古麗·木拉提.改良牛泰勒焦蟲病的調(diào)查及診治[J].農(nóng)村科技,2004,(05):14.

[5]曹雯麗,陳亮,劉啟生,等.新疆牛環(huán)形泰勒蟲病的流行現(xiàn)狀和防治[J].草食家畜,2011,(03):76-78.

[6]Christine D, Oliveira, Marjo Van Der Weide, Miguel A, et al.Detection of the protozoan parasite theileria annulata in Hyalomma ticks by the polymerase chain reaction[J]. Journal Of Clinical Microbiology, 1995,33(10):2665-2669.

[7]阿爾孜古力·艾乃都,郭彥軍.新疆托克遜縣草地資源概況及利用對(duì)策[J].草原與草坪,2012,(01):87-96.

[8]沙塔爾·卡哈爾,曹雯麗,張揚(yáng),等.吐魯番部分疫區(qū)牛環(huán)形泰勒蟲病流行病學(xué)調(diào)查[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013,(06):1161-1164.

Investigation of Two Detection Methods on the Infection of Cattle Theileria Annulata

HE Xiao-dong，YI Chun-yang，YANG Hong-xia，GUO Qing-yong*，BAYINCHAHAN*
（College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052，China）

The blood samples of 104 cattle in four aging groups were detected to identify the infection of Theileria annulata. The results by blood smear microscope and PCR demonstrated an infection rate of 51.0%(53/104)and 57.7%(60/104), respectively. Furthermore, a much higher infection rate(72.4%; 8/11)was observed among cattle at 1-2 years old.

theileria annulata; cattle; detection method; infection rate

S852.7

B

1003－6377（2015）03－0047-04

新疆高?？蒲杏?jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（XJEDU2013I18）

何曉東（1990-），男（回族），碩士在讀。E-mail:1498730319@qq.com

郭慶勇（1973-），男，副教授，碩導(dǎo)，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床寄生蟲病防治。

E-mail:wlmqgqy@126.com巴音查汗（1964-），女（蒙古族），教授，博導(dǎo)，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。

2015-02-05,

E-mail: bynch@hotmail.com