草果果腐病拮抗產芽孢細菌的篩選與鑒定

郭建偉　羅冰　楊麗芬　楊建　田學軍　劉艷紅　胡銳菊

摘要：以草果果腐病鐮刀菌作為指示菌篩選拮抗產芽孢細菌，結果表明健康果實比患病果實的細菌多樣性高，但相對抑制率≥35%的高拮抗菌株均分離自病果，并通過形態(tài)學及生理生化特征鑒定出8株枯草芽孢桿菌、1株解淀粉芽孢桿菌、1株嗜堿芽孢桿菌、1株花園芽孢桿菌、1株苛求芽孢桿菌及3株革蘭氏陽性產芽孢球菌。

關鍵詞：鐮刀菌；產芽孢細菌；草果生物防治

中圖分類號： S432.4+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0176-03

草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemaire），又名草豆蔻，多年生常綠叢生草本植物，隸屬姜科豆蔻屬，主要分布我國云南、廣西和貴州等省（區(qū)）局部地區(qū)；果實性溫、濃香，具有健胃、消食、順氣、祛寒濕等藥效，也是上好的烹調佐料[1]。云南南部、東南部和西南部的亞熱帶雨林種植廣泛，萎蔫病、葉斑病、疫病等常見病害日益引起研究者的關注[2-4]；另據(jù)本團隊調查，花腐病、果腐病、立枯病在云南紅河州的屏邊、元陽、綠春均有暴發(fā)，其中果腐病已遍及文山、紅河、綠春、金屏、屏邊多個縣（區(qū)）的草果產區(qū)，常導致果穗腐爛、脫落，果實腐爛，葉片枯死，其病原菌為鐮刀菌（Fusarium sp.）。

產芽孢細菌，尤其是藥用植物內生菌在植物病害生物防治和促進植物生長方面有著重要的應用價值[5]；這類細菌突出的特征是能產生耐熱抗逆的芽孢，有利于生防菌劑的生產、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖[6]；目前應用廣泛的產芽孢細菌種類有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilies）、多黏芽孢桿菌（B.polymyxa）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、蠟狀芽孢桿菌蕈狀變種（B. cereus var. mycoides）等[7]。因而，本研究擬從草果根際土壤及果實分離耐高溫（80 ℃恒溫處理30 min）細菌，繼而篩選對果腐病鐮刀菌具有高拮抗活性的菌株，再進行形態(tài)學及生理生化特征鑒定，重點篩選芽孢桿菌為后續(xù)生防菌劑的開發(fā)提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病原菌：草果果腐病鐮刀菌（Fusarium sp.）菌株F1。

供試土樣及草果果實：供試土樣于2011年10月采自云南省紅河州金屏縣馬鞍底鄉(xiāng)草果種植區(qū)的患病植株根際，以無菌鏟子刮去表層土壤，每個樣點取15～30 cm深度的草果根際土30 g；供試草果果實于2012年7—8月采自屏邊縣石寨村、白沙村、倉房村、新現(xiàn)村及蒙自市崗壇子。

培養(yǎng)基：PDA、LB、硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基、淀粉水解試驗培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、牛奶培養(yǎng)基等[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐高溫細菌的分離、純化 土樣細菌分離：將土壤樣品磨碎、混勻、過篩（100目），每份樣品取2 g細土樣放入盛有18 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，120 r/min室溫振蕩1 d，使土樣分散并與水混合，置于80 ℃水浴30 min以殺死微生物菌體和其他雜菌保留芽孢[9]。熱處理后靜置 5 min，吸取1 mL土壤懸液加入盛有9 mL無菌水的大試管中充分混勻，再吸取1 mL加入另一盛有9 mL無菌水的大試管中搖勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同稀釋度的土壤溶液[8]。取各梯度土壤懸液涂布于LB培養(yǎng)基中，每個梯度3次重復，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

果實內生細菌的分離：剪取健康草果或果腐病病果的健康部位，采用郭建偉等的方法[9]進行表面消毒，即先以75%乙醇消毒5 min，再轉入10%次氯酸鈉溶液中消毒8 min，沖洗2～3遍后用無菌剪刀剪取5 g，放入研缽中加入少量無菌水、石英砂快速研磨，研磨之后放入無菌燒杯中加20 mL無菌水溶解，置于80 ℃水浴30 min[10]。熱處理后靜置5 min，取上清液30 μL稀釋100倍（相當于總共稀釋500倍）后取30 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，每份樣品3個重復，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

純化：待長出菌落后，根據(jù)菌落邊沿是否整齊、光滑、中央是否突起、正反面顏色挑取不同的菌體劃線，35 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后根據(jù)菌落形態(tài)及鏡檢菌體形態(tài)確定是否為純菌落，若不純則繼續(xù)劃線分離。

1.2.2 根腐病拮抗菌株的篩選 將細菌純菌株以三點接種法與病原菌接在加有蛋白胨的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d；測量抑菌圈半徑（抑菌圈半徑是病原菌菌落半徑減去病原菌接種點到凹痕的距離），以不接種細菌的平板作對照測量病原菌半徑，根據(jù)測量結果計算相對抑菌率（相對抑菌率=抑菌圈半徑/病原菌半徑×100%）[11]。

1.2.3 根腐病高拮抗菌株的形態(tài)及生理生化鑒定 對相對抑菌率≥35%的拮抗菌株進行革蘭氏染色、芽孢染色、耐鹽、耐高溫、V.P試驗、厭氧性試驗、檸檬酸鹽利用試驗、接觸酶試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、酪素水解試驗等形態(tài)觀察及生理生化特征鑒定[8]。

2 結果與分析

2.1 耐高溫細菌的分離

從采集自不同地方的草果果實及土壤樣品中經80 ℃處理、稀釋涂布、劃線培養(yǎng)等方法共分離純化得到208株細菌。由表1可見，健康果實比病果的細菌數(shù)量更為豐富；細菌分布具有一定的地方差異性，屏邊縣白沙村健康果實、病果的細菌多樣性最高，新現(xiàn)村健康果實、病果的細菌多樣性最低。

2.2 根腐病拮抗菌株的篩選

經對峙培養(yǎng)法，從208株細菌中篩選出35株具有一定抑菌活性的菌株，其中屏邊石寨村草果果實細菌中篩選到8株拮抗菌，6株相對抑菌率≥35%；白沙村篩選到7株拮抗菌，3株相對抑菌率≥35%；新現(xiàn)村篩選到2株拮抗菌，1株相對抑菌率≥35%；倉房村篩選到5株拮抗菌，2株相對抑菌率≥35%；蒙自崗壇子村草果果實細菌篩選到5株拮抗菌，2株相對抑菌率≥35%；金平縣馬鞍底鄉(xiāng)果梗、果實均感染果腐病鐮刀菌的根際土壤細菌中篩選到8株拮抗菌，相對抑菌率均低于35%（表2）。相對抑菌率≥35%的拮抗菌株均分離自患病草果果實，可能因為健康草果樣品較少、細菌多樣性高但優(yōu)勢種群少，不利于拮抗菌株的篩選。endprint

2.3 果腐病高拮抗菌株的鑒定

參照文獻[8]，經形態(tài)學與生理生化鑒定，PSB-1、PSB-2、PSB-13、PSB-17、PBB-11、PCB-9、PCB-10、MGB-6等8株菌為枯草芽孢桿菌（B. subtilis），PBB-19初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），PSB-8初步鑒定為嗜堿芽孢桿菌（B. alcalophilus），MGB-7初步鑒定為花園芽孢桿菌（B. horti），MGB-16初步鑒定為苛求芽孢桿菌（B. fastidious）；另有PSB-31、PBB-12、PXB-14 等3株菌，均產圓形或橢圓形芽孢，革蘭氏陽性、接觸酶、硝酸鹽還原、V. P反應、淀粉水解、酪素水解均為陽性，能耐5% NaCl及40 ℃以上高溫，除PXB-14檸檬酸鹽反應陰性外其余2株為陽性，僅能鑒定到革蘭氏陽性產芽孢球菌（如表3所示），具體屬、種分類地位尚須進一步研究。

本研究以80 ℃處理30 min篩選草果果腐病產芽孢拮抗菌，篩選到的15株相對抑制率≥35%的拮抗菌株均能產芽孢，表明這種篩選產芽孢細菌的方式是有效的。

3 結論與討論

內生菌定植于植物組織內部不易受環(huán)境條件影響而成為重要的微生物農藥、增產菌，根際微生物是定殖于植物根際能直接或間接促進植物生長的微生物[12]。由于草果在根際萌花并結果，草果果實極易受到周圍及根際土壤、果實表面微生物的影響，因而本研究為擴大篩選防治草果果腐病并利于加工生防菌劑的菌株來源，選擇健康及患病草果、病株根際土壤篩選耐高溫細菌，從13份樣品中共篩選到208株細菌，35株對果腐病鐮刀菌具有一定的室內抑制作用，其中相對抑制率≥35%的有15株，經鑒定均能產芽孢，大部分屬于芽孢桿菌屬甚至枯草芽孢桿菌，這與陳波等的研究結果[13]基本一致但有所差異。差異的原因可能在于：一是采樣地點環(huán)境及管理的差異性，本研究中草果種植于保留松樹等部分山林樹種或具有人工栽培旱冬瓜作為遮陰植物的山坡，與同因鐮刀菌引起的香蕉種植園相比排水性好卻極少施肥，對土壤微生物及草果果實內生、附生微生物種群的人為干擾較少；二是分離樣品的差異性，本研究采用草果果實、病株根際土壤分離耐高溫拮抗微生物，比后者香蕉健康及枯萎病植株根際細菌的豐度高但排除了葡萄球菌屬等不產孢細菌類群。在產芽孢細菌的分離技術方面與王松等的研究[5]相比，本研究先采用高溫處理去除其他非產芽孢細菌的干擾，分離效率更高，但后者在分離細菌后進行芽孢染色觀察排除非產芽孢細菌的干擾，也提高了分離效率，若結合2種處理篩選拮抗產芽孢細菌，可能分離效率更高。

PSB-8、PSB-13、PBB-12、PCB-10、MGB-7、MGB-16對草果果腐病鐮刀菌的相對抑菌率均大于60%，除PBB-12外均屬于芽孢桿菌屬，而PBB-12屬于革蘭氏陽性產芽孢球菌，既具有高拮抗性又都具有可抗逆境的芽孢，便于開發(fā)抗逆性強、耐貯存的生防菌劑，因而均具有較好的應用前景。有研究表明大量的根際有益微生物具有固氮、解磷、產生植物激素等促進植物生長和防治病害的能力，內生細菌主要為兼性內生的土壤細菌，目前還不清楚其促生長機制是單個微生物還是多種微生物類群的作用[14]。本研究雖未從病株根際土壤篩選到高拮抗性的產芽孢細菌，但數(shù)量多達8株，因而根際土壤拮抗產芽孢細菌也具有一定的應用潛能。

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