何佳昱　丁明亞　楊志輝　朱杰華

摘要：對(duì)2012年采自河北省圍場(chǎng)縣永和棧、銀窩溝、克勒溝、小葦子溝、扣花營5個(gè)地點(diǎn)的60株晚疫病菌測(cè)定了其交配型、甲霜靈抗性、mtDNA單倍型、SSR基因型，結(jié)果表明，60株晚疫病菌全部為A1交配型，甲霜靈高抗菌株58株，占96.67%；敏感菌株2株，占3.33%。采用以PCR方法為基礎(chǔ)的mtDNA單倍型檢測(cè)新方法共鑒定出ⅠR3、ⅡR3、ⅡR2 3種mtDNA單倍型。其中，ⅠR3單倍型為該群體的優(yōu)勢(shì)單倍型，占80.0%；ⅡR3、ⅡR2 分別占18.3%、1.7%。同時(shí)，還利用具有多態(tài)性的8對(duì)引物測(cè)定了該群體的SSR基因型，共檢測(cè)到18個(gè)等位基因、5種基因型。SSR聚類結(jié)果表明，SSR基因型與菌株對(duì)甲霜靈抗性有一定相關(guān)性，而與交配型和地理來源無相關(guān)性。圍場(chǎng)縣晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)比較單一，遺傳多樣性程度較低。

關(guān)鍵詞：致病疫霉；甲霜靈抗性；mtDNA單倍型；SSR基因型

中圖分類號(hào)： S435.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0179-04

河北省圍場(chǎng)縣是中國人民共和國農(nóng)業(yè)部命名的第一批國家級(jí)馬鈴薯生產(chǎn)基地縣，是“中國馬鈴薯之鄉(xiāng)”，馬鈴薯年種植面積穩(wěn)定在 30 000 hm2，年產(chǎn)鮮薯5億～6億kg，年產(chǎn)值 3 000萬～4 000萬元[1]。由于馬鈴薯晚疫病的發(fā)生與流行，馬鈴薯產(chǎn)量損失約 4 500 kg/hm2，經(jīng)濟(jì)損失超過2 000元/hm2[2]。晚疫病的發(fā)生與流行和病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)變化有密切聯(lián)系[3-5]。了解一個(gè)區(qū)域晚疫病菌的群體結(jié)構(gòu)是制定該地區(qū)晚疫病防控技術(shù)的理論基礎(chǔ)。2000年，朱杰華等在圍場(chǎng)縣首次發(fā)現(xiàn)了晚疫病菌A2交配型[6]。2002年，王文橋等在圍場(chǎng)縣再次發(fā)現(xiàn)A2交配型，但之后檢測(cè)中并未發(fā)現(xiàn)A2交配型[7-8]。2006年，姚國勝等報(bào)道，圍場(chǎng)縣甲霜靈高抗菌株占被測(cè)菌株的88.5%[9]。2012年，王文橋等發(fā)現(xiàn)，河北省甲霜靈抗性菌株所占比例由2007年的100%降為2008年的664%，2009年又回升為74.2%[8]。為了更好地揭示晚疫病的群體結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化，國內(nèi)學(xué)者采用了分子技術(shù)對(duì)其進(jìn)行研究[10]。2000年，朱杰華等采用RAPD方法研究了DNA多態(tài)性與A2交配型之間的關(guān)系，認(rèn)為兩者之間具有一定的相關(guān)性，各地的晚疫病菌系出現(xiàn)不同程度的群體分化現(xiàn)象[11]。2008年，楊志輝等利用12對(duì)AFLP引物組合對(duì)1996—2002年采自河北省的晚疫病菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，群體結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，遺傳多樣性較低[12]。姚國勝等首次利用SSR標(biāo)記研究晚疫病菌的基因型結(jié)構(gòu)，利用Pi4B、Pi4G 2對(duì)引物于河北省47株馬鈴薯晚疫病菌中鑒定出4個(gè)SSR基因型，并發(fā)現(xiàn)1種新的基因型F-06[13]。2009年，陳良華對(duì)1997—2007年采自圍場(chǎng)縣的致病疫霉菌株mtDNA進(jìn)行單倍型測(cè)定，僅發(fā)現(xiàn)Ⅱa 1種單倍型[10]。本研究測(cè)定2012年圍場(chǎng)縣晚疫病菌群體的表型、基因型，明確當(dāng)前該地區(qū)晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)，與以前群體的性狀進(jìn)行比較，了解圍場(chǎng)縣晚疫病菌群體的動(dòng)態(tài)變化，為圍場(chǎng)縣馬鈴薯晚疫病防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2012年在圍場(chǎng)縣永和棧、銀窩溝、克勒溝、小葦子溝、扣花營等5個(gè)地點(diǎn)共采集并分離60株單病斑馬鈴薯晚疫病菌。

1.1.2 供試藥劑 98%甲霜靈原藥由河北省雙吉化工有限公司提供，二甲亞砜（DMSO）由北京博奧拓達(dá)科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 黑麥培養(yǎng)基：黑麥60 g，蔗糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 交配型測(cè)定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法將供試菌株與A1、A2交配型標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種在黑麥培養(yǎng)基平板上，置于18 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，顯微鏡觀察菌落交界處是否出現(xiàn)卵孢子。若待測(cè)菌株與A1產(chǎn)生卵孢子，則待測(cè)菌株為A2交配型；若待測(cè)菌株與A2產(chǎn)生卵孢子，則待測(cè)菌株為A1交配型[14]。

1.2.2 甲霜靈敏感性測(cè)定 將供試菌株分別接種在含甲霜靈0、5、100 μg/mL的黑麥培養(yǎng)基平板中央，置于18 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落直徑大于50 mm時(shí)，參照Lee等的方法[15]測(cè)量并記錄菌株甲霜靈敏感性。

1.2.3 mtDNA單倍型測(cè)定 采用Yang等的方法[16]對(duì)供試菌株的2個(gè)高變區(qū)即 HVRi、 HVRii進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。對(duì)致病疫霉線粒體2個(gè)高變區(qū)多態(tài)性片段進(jìn)行分析，致病疫霉存在6種線粒體單倍型即 ⅠR1、ⅠR2、ⅠR3、ⅡR1、ⅡR2、ⅡR3。

1.2.4 SSR基因型測(cè)定 選取8對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記測(cè)定晚疫病菌SSR基因型，即張宏磊等開發(fā)的5對(duì)引物（I-07111、I-07122、F5-22735、E-14923、E-17965）[17]和Li等開發(fā)的3對(duì)引物（D13、PinfSSR8、PinfSSR4）（表2）[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配型測(cè)定

2012年圍場(chǎng)縣采集的60株晚疫病菌交配型組成單一，均為A1交配型，未發(fā)現(xiàn)A2交配型或自育型菌株，表明圍場(chǎng)縣馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)發(fā)生有性生殖的可能性很小。

2.2 甲霜靈敏感性測(cè)定

甲霜靈敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，圍場(chǎng)縣60株致病疫霉中，抗性菌株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。高抗菌株58株，占96.67%；無中抗菌株；敏感菌株2株，占3.33%。2株敏感菌株分別是JW12-25、JW12-59，分別采自克勒溝、銀窩溝，由此可知，克勒溝、銀窩溝地致病疫霉群體仍有很少比例的甲霜靈敏感菌株存在，而其他采集地可能全部為抗性菌株。

2.3 mtDNA單倍型分析

以mtDNA單倍型方法對(duì)60株致病疫霉共鑒定出ⅠR3（泳道1、2、5、6、7、10）、ⅡR2（泳道4）、ⅡR3（泳道3、8、9）3種單倍型，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1）。mtDNA單倍型在致病疫霉群體中的分布比率如圖2所示，從高變區(qū)HVRi來看以Ⅰ型為主，占80%；從高變區(qū)HVRii來看，R3型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占98%，R2型僅占2%，無R1型。從2個(gè)高變區(qū)HVRi、HVRii組合來看，48株致病疫霉mtDNA單倍型為ⅠR3，占800%；11株單倍型為ⅡR3，占18.33%；僅檢測(cè)到1株單倍型為ⅡR2，占1.67%。endprint

由圖3可知，永和棧、銀窩溝、克勒溝、小葦子溝、扣花營等5個(gè)采樣點(diǎn)中，ⅠR3分布最廣，在每個(gè)采樣點(diǎn)都有分布，且絕大多數(shù)都是該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)線粒體單倍型。ⅡR3分布也很廣，除小葦子溝未發(fā)現(xiàn)外，其他4個(gè)采樣點(diǎn)都有發(fā)現(xiàn)。ⅡR2僅在克勒溝發(fā)現(xiàn)了1株。綜上所述，克勒溝的晚疫病菌線粒體單倍型最多，小葦子溝采樣點(diǎn)晚疫病菌線粒體單倍型最少，僅存在ⅠR3，說明圍場(chǎng)縣晚疫病菌群體以ⅠR3為主，占80%，不同地區(qū)間晚疫病菌群體也存在著一定的遺傳差異。

2.4 SSR基因型分析

利用8對(duì)SSR引物對(duì)60株被測(cè)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析電泳圖譜，共檢測(cè)到18個(gè)等位基因。根據(jù)8個(gè)基因座上等位基因的組合，將被測(cè)菌株分為5個(gè)基因型，分別用大寫英文字母A、B、C、D、E來表示，基因型A 38株，占63.33%，且在5個(gè)采樣點(diǎn)均有分布，具絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；基因型D有11株，占18.33%，僅次于基因型A，主要分布在銀窩溝；基因型B、基因型C分別有8、1株，分別占13.33%、1.67%，主要分布在克勒溝與銀窩溝；基因型E有2株，占3.33%，分別來自克勒溝、銀窩溝。5個(gè)采樣點(diǎn)中，銀窩溝基因型最豐富，包含A、B、D、E 4種SSR基因型；其次為克勒溝與扣花營，分別包含A、B、E和A、C、D 3種SSR基因型；永和棧與小葦子溝的基因型比較單一，均為基因型A。由此可知，不同地區(qū)致病疫霉SSR基因型之間有一定差異。根據(jù)8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析（圖4），當(dāng)相似系數(shù)為0.75時(shí)，被測(cè)菌株分為α、β 兩大分支，其中α分支包括58個(gè)菌株，包括A、B、C、D 4種SSR基因型，且均為甲霜靈高抗菌株；β分支僅有2個(gè)菌株，僅包括1種SSR基因型，為甲霜靈敏感菌株。由此可知，菌株的SSR基因型與甲霜靈抗性間存在一定的相關(guān)性，甲霜靈抗性群體數(shù)量、遺傳多樣性都明顯高于甲霜靈敏感群體。此外，圍場(chǎng)縣晚疫病菌群體SSR基因型與地理來源、線粒體單倍型無相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

從交配型、甲霜靈抗性等表型測(cè)定結(jié)果來看，近10年來圍場(chǎng)縣晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)幾乎未發(fā)生變化。本研究結(jié)果表明，2012年采自圍場(chǎng)縣的60株晚疫病菌均為A1交配型，絕大多數(shù)為甲霜靈高抗菌株，占96.67%。朱杰華等[6]、王文橋等[7]發(fā)現(xiàn)河北省存在A2交配型。沈江衛(wèi)等研究表明，采自圍場(chǎng)縣的晚疫病菌全部為A1型。這意味著晚疫病菌A2交配型在2000年前后可能通過種薯調(diào)運(yùn)傳播到圍場(chǎng)縣，之后隨著晚疫病菌群體的年度間遺傳飄變而消失，可能是由于A2交配型病菌不適合圍場(chǎng)縣的氣候類型[19]。李煒等研究表明，采自圍場(chǎng)縣的49株晚疫病菌中，40.8%表現(xiàn)高度抗性，49%表現(xiàn)中度抗性[20]。陳良華等對(duì)甲霜靈抗性的檢測(cè)結(jié)果表明，高抗菌株分別占被測(cè)菌株的88.5%與72.3%[21]。這說明河北圍場(chǎng)晚疫病菌群體從20世紀(jì)90年代已對(duì)甲霜靈產(chǎn)生了普遍的抗藥性，且抗性程度高，但生產(chǎn)中仍有不少農(nóng)戶還采用含有甲霜靈成分的藥劑來防控馬鈴薯晚疫病，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的教育，讓他們不再使用該類藥劑防控晚疫病，以免浪費(fèi)人力物力，給當(dāng)?shù)丨h(huán)境造成惡劣影響。

以PCR為基礎(chǔ)的線粒體單倍型檢測(cè)方法更有利于揭示晚疫病群體的多樣性，發(fā)現(xiàn)其動(dòng)態(tài)變化。2008年，Guo等報(bào)道，中國北方地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌mtDNA單倍型單一，僅存在Ⅱa 1種[22]。本研究采用以PCR為基礎(chǔ)的mtDNA單倍型檢測(cè)方法，在圍場(chǎng)縣共發(fā)現(xiàn)了ⅠR3、ⅡR2、ⅡR3 3種單倍型，其中ⅠR3占80.00%，其次為ⅡR2，占18.33%，此外還發(fā)現(xiàn)了1株ⅡR2單倍型。筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)圍場(chǎng)縣致病疫霉mtDNA單倍型近幾年監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，2004年僅檢測(cè)到ⅠR3單倍型；2006年檢測(cè)到ⅠR3、ⅡR2 2種單倍型，90%的菌株為ⅠR3，10%的菌株為ⅡR2；2007年檢測(cè)到ⅠR3、ⅡR2、ⅡR3 3種單倍型，58.82%為ⅠR3，35.29%為ⅡR2，剩余1.67%為ⅡR3；2011年檢測(cè)到ⅠR3、ⅡR32種單倍型，82.35% 為ⅠR3，17.65%為ⅡR3，這表明圍場(chǎng)縣馬鈴薯晚疫病菌群體年度間不斷發(fā)生變化。

本研究結(jié)果表明，SSR基因型與晚疫病菌對(duì)甲霜靈抗性有一定相關(guān)性，這與吳婧蓮等的研究結(jié)果[23]一致。2002年，Knapova 等利用AFLP、SSR 2種分子標(biāo)記對(duì)采自瑞士及法國的馬鈴薯、番茄的致病疫霉群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，AFLP、SSR分子標(biāo)記所檢測(cè)遺傳多樣性與致病疫霉地理來源、生理小種、交配型、甲霜靈抗性等表型之間并無相關(guān)性[24]。姚國勝等對(duì)河北省、黑龍江省致病疫霉群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記與甲霜靈抗性、交配型也沒有相關(guān)性[13]。Mahuku等認(rèn)為，可能是交配型、生理小種和對(duì)甲霜靈抗性等表型變異僅與1個(gè)或幾個(gè)基因變異程度有關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明，SSR基因型與甲霜靈抗性具有相關(guān)性，筆者認(rèn)為，這主要是由于敏感菌株在群體中的比例極小，因此它形成了1個(gè)單獨(dú)的SSR基因型。圍場(chǎng)縣馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)一直在改變，由于線粒體單倍型和SSR基因型較交配型和甲霜靈抗性等表型性狀相比具有更高的多樣性，因此在晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)演化中具有更重要的作用。

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