楊尚雪　李珣　王曉曄　石博妹　唐胤晟　許春榮　唐榮福　胡傳活

摘要：課題組前期試驗表明，0.08%水蛭素能夠顯著提高凍后豬精液質(zhì)量。為研究其作用機(jī)理，用含不同濃度（0、0.04%、0.08%、0.12%）水蛭素的稀釋液稀釋美系長白公豬精液，分別檢測平衡后及凍融后精液中超氧化物歧化酶的活性和mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：（1）不含水蛭素的冷凍稀釋液顯著降低新鮮豬精液超氧化物歧化酶活性（P0.05）；（2）含有0.08%水蛭素的豬精液平衡及凍融后的超氧化物歧化酶mRNA表達(dá)量最高，但差異不顯著（P>0.05）?？傊?，添加0.08%水蛭素對冷凍前后豬精液超氧化物歧化酶活性及mRNA表達(dá)無顯著影響。

關(guān)鍵詞：豬精液；冷凍保存；水蛭素；超氧化物歧化酶；酶活性；mRNA表達(dá)量

中圖分類號： S828.3+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0275-04

冷凍保存過程對精子質(zhì)膜產(chǎn)生物理和化學(xué)應(yīng)激，降低精子凍后質(zhì)量，影響活力與受精能力[1]。這些損傷均與冷凍保存過程引起精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關(guān)[2-4]。用于冷凍保存的新鮮豬精液中添加合適的冷凍稀釋液非常重要。研究表明，稀釋液中添加抗氧化劑能有效防止氧化應(yīng)激傷害精子，常見的如半胱氨酸、維生素E可以延長凍后精子壽命[5-9]。水蛙素提取自水蛭的唾液腺，是由65～66個氨基酸殘基所組成的單鏈多肽，具有降血脂、抗腫瘤、抗凝血等多種藥理活性，廣泛用于臨床治療各種疾病[10]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)水蛭素具有抗氧化作用，本課題的前期研究也表明，0.08%的水蛭素能顯著改善凍后豬精液質(zhì)量，但其作用機(jī)理尚不明了。本試驗用添加不同濃度水蛭素的冷凍稀釋液稀釋精液后，檢測平衡及冷凍解凍后豬精液中固有抗氧化酶——超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及其mRNA表達(dá)量的變化，以期從SOD活性及分子水平闡明水蛭素對冷凍前后豬精液中SOD功能及濃度的影響，為深入探討水蛭素提高凍后豬精液質(zhì)量的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 異丙醇、無水乙醇和氯仿為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、蛋白酶抑制劑（PMSF）、青霉素與鏈霉素均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，卵黃取自廣西南寧市富鳳農(nóng)牧有限公司生產(chǎn)的初產(chǎn)雞蛋，水蛭素（活力單位為1 250 U/g）為南寧市凈雪皇生物工程有限公司產(chǎn)品，BCA蛋白濃度測定試劑盒和SOD檢測試劑盒均為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，RIPA裂解液、Trizol、 HiScript Q 1st Strand cDNA Synthesis Kit （qPCR）和2 × Taq Master Mix均購于南京諾唯贊生物科技有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要儀器 程序降溫儀（法國卡蘇公司）、冰箱（海爾集團(tuán)）、電子恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）、移液槍（Eppendorf）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、0.25 mL塑料細(xì)管（Minitube）、梯度PCR儀（Biometra）、水平電泳槽及電泳儀電源（北京凱元儀器有限公司）、iMARK酶標(biāo)儀（Bio-rad）。

1.1.3 精液來源 新鮮精液采自3頭廣西科達(dá)畜禽改良有限責(zé)任公司健康、性欲旺盛的美系長白種公豬。采用手握法采精，收集富含精子段的精液于預(yù)溫的潔凈燒杯中，1 h內(nèi)送達(dá)實驗室處理。用8層紗布過濾后，檢查相關(guān)的精液質(zhì)量指標(biāo)（精子活力、畸形率及密度）。精子活力>0.7、畸形率<20%的精液繼續(xù)用于后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 分組 試驗分組見表1。

1.2.2 冷凍稀釋液配制 用電子天平按配方（葡萄糖1.65%，檸檬酸2.22%，Tris 3.63%，NAC 0.03%，青霉素0.09%，鏈霉素0.15%，甘油9.00%，蛋黃30.00%）[11]準(zhǔn)確稱取各種試劑，雙蒸水溶解定容，5 000 r/min離心15 min。

1.2.3 精液冷凍程序 用10層紗布包裹精液，放在室溫下緩慢降溫。原精與含有不同濃度（0、0.04%、0.08%、0.12%）水蛭素的稀釋液室溫下等溫稀釋，稀釋比為1 ∶ 2（先加入1份與原精等量的稀釋液，混合均勻，平衡15 min后，再加入另1份與原精等量的稀釋液）。0.5 mL塑料細(xì)管分裝，10層以上紗布包裹后將細(xì)管放入冰箱內(nèi)，5 ℃下平衡4 h。取出細(xì)管，檢查平衡后精子活力合格后，放入程序降溫儀：5～-5 ℃，3 ℃/min；-5～-42 ℃，100 ℃/min；-42～-140 ℃，30 ℃/min。冷凍程序運行完成后，取出細(xì)管迅速投入液氮中。

1.2.4 冷凍精液解凍方法 從液氮中取出細(xì)管，迅速投入37 ℃水浴，快速晃動30～60 s。

1.2.5 SOD活性檢測

1.2.5.1 細(xì)胞總蛋白的提取 將各組精液從0.5 mL塑料細(xì)管中倒入2.0 mL離心管中，輕微振蕩，吸取500 μL加入1 000 μL冷的裂解液（每1 mL冷的RIPA裂解液中加入2 μL PMSF混合物，混勻后置冰上備用），混勻后，在4 ℃條件下振蕩15 min，在4 ℃、14 000 r/min條件下離心15 min?？焖賹⑸锨逦肓硪活A(yù)冷的干凈離心管，用于后續(xù)試驗。

1.2.5.2 BCA蛋白濃度測定 按照說明書進(jìn)行，步驟如下：先配制成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，取適量25 mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，滅菌生理鹽水稀釋至終濃度為0.5 mg/mL；其次配制BCA工作液（BCA試劑A ∶ BCA試劑B=50 ∶ 1），充分混勻；然后將標(biāo)準(zhǔn)品按0、 1、 2、 4、8、12、16、20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加滅菌生理鹽水補(bǔ)足到20 μL；加10 μL樣品到96孔板的樣品孔中，加滅菌生理鹽水到20 μL；最后各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20 min后，測定吸光度D595 nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度。endprint

1.2.5.3 SOD酶活性測定 采用WST-8法，步驟如下：首先配制適量的WST-8/酶工作液以及反應(yīng)啟動工作液；然后取20 μL待測樣品到96孔板中，加入160 μL WST-8/酶工作液以及20 μL反應(yīng)啟動工作液，相應(yīng)的空白對照1為20 μL SOD檢測液、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反應(yīng)啟動工作液，空白對照2為40 μL SOD檢測液和160 μL WST-8/酶工作液，空白對照3為20 μL待測樣品、20 μL SOD檢測液和160 μL WST-8/酶工作液；37 ℃孵育30 min；測定吸光度D450 nm。SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶耦聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為1個酶活力單位（U）。

1.2.6 SOD mRNA表達(dá)水平的檢測

1.2.6.1 細(xì)胞總RNA的提取 將各組精液從0.5 mL塑料細(xì)管中倒入2.0 mL離心管中，加入1 mL RNA isolater，上下顛倒混勻，加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩，4 ℃靜置10 min，12 000 g 、4 ℃離心15 min，小心吸取上層水相500 μL至含有600 μL 異丙醇的離心管中，上下顛倒混勻，4 ℃靜置10 min，12 000 g 、4 ℃離心10 min，去上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌，12 000 g 、 4 ℃ 離心5 min，棄上清，將離心管倒扣在滅菌衛(wèi)生紙上3 min，加入4 μL滅菌三蒸水溶解沉淀。

1.2.6.2 cDNA合成 cDNA合成反應(yīng)液體系：RNase free ddH2O 3 μL，50 μmol/L Oligo dT23VN 1 μL，2 × RT Mix 10 μL，HiScriptTM Ⅱ Enzyme Mix 2 μL，總RNA 4 μL。上述體系配制均在冰上進(jìn)行，完成后，50 ℃ 水浴 45 min。

1.2.6.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） RT-PCR反應(yīng)液體系：ddH2O 6.5 μL，2 × Taq Plus Master Mix 12.5 μL，模板DNA 4 μL，10 μmol/L引物1、引物2（表2） 各1 μL。上述體系配制在冰上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)X次；72 ℃延伸7 min。

SOD與GAPDH的最優(yōu)退火溫度的確定是根據(jù)DNA分子的熔點（Tm）設(shè)置溫度梯度，比較相同RT-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)圈數(shù)下不同溫度的RT-PCR產(chǎn)物的表達(dá)水平，表達(dá)量最高的溫度為最優(yōu)退火溫度，最終SOD與GAPDH的最優(yōu)退火溫度為58 ℃；SOD與GAPDH的最優(yōu)循環(huán)圈數(shù)的確定是通過設(shè)置不同循環(huán)圈數(shù)，比較相同RT-PCR反應(yīng)體系和退火溫度下不同循環(huán)圈數(shù)的RT-PCR產(chǎn)物的表達(dá)水平，到達(dá)平臺期的第1個循環(huán)圈數(shù)即為最優(yōu)循環(huán)數(shù)，最終SOD為38圈，GAPDH為36圈。

用Quantity One分析系統(tǒng)分析DNA條帶光密度，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”描述，釆用單因素方差分析，各種檢驗的顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD活性試驗

由圖1可知，新鮮精液在不添加冷凍稀釋液且不平衡不冷凍（第1組）的條件下，SOD活性最高（P<0.05），添加不含水蛭素的冷凍稀釋液（第2組）后，SOD活性顯著降低（P0.05），但添加0.08%水蛭素精液的SOD活性（第5組與第9組）分別在平衡組與凍融組中最高（P>0.05）。

2.2 SOD mRNA表達(dá)水平試驗

由圖2、圖3可知，新鮮精液在不添加冷凍稀釋液且不平衡不冷凍（第1組）的條件下，SOD mRNA表達(dá)量最高，添加

不含水蛭素的冷凍稀釋液（第2組）后，與第1組相比SOD mRNA表達(dá)降低，但差異不顯著（P>0.05）；僅平衡的豬精液添加0.08%的水蛭素（第5組）與不含水蛭素既平衡又冷凍（第3組）相比SOD mRNA表達(dá)高但差異不顯著（P>0.05），與新鮮精液（第1組）無顯著差異（P>0.05）；既平衡又冷凍的豬精液添加0.08%的水蛭素SOD mRNA表達(dá)比不含水蛭素既平衡又冷凍（第7組）的高（P>0.05），與新鮮精液（第1組）無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

ROS對維持正常精子的功能至關(guān)重要，如受精能力的獲得、染色質(zhì)凝集的促進(jìn)、質(zhì)膜的重建以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活等[12-14]。正常情況下，精子體內(nèi)的促氧化與抗氧化水平相互平衡。然而，這一平衡狀態(tài)被冷凍保存過程打破了，產(chǎn)生了大量富余的ROS，引起精子氧化應(yīng)激造成損傷。在冷凍稀釋液中添加合適濃度的抗氧化劑對于清除多余的ROS保護(hù)精子非常重要。超氧陰離子自由基（O-2 · ）是生物體內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物，但其不正常的積累將使細(xì)胞膜的脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用而引起膜裂變，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡[15]。SOD是消除 O-2 · 最有效、最重要的抗氧化物酶，其催化自由基 O-2 · 發(fā)生歧化作用生成O2與H2O2，然后H2O2被體內(nèi)如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶清除，因而SOD是體內(nèi)防止自由基損傷的第一道防線，是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶[16]。SOD廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，在醫(yī)藥、食品、化妝品中有廣泛的應(yīng)用前景[17]。從SOD水平的高低可以看出機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的狀態(tài)。

水蛭素是從藥用水蛭中提取的含有65或66個氨基酸殘基的多肽鏈[18-19]。其性味咸、苦、平，有小毒，入肝經(jīng)，具有破血逐淤之功效，主要用于血淤經(jīng)閉及跌打損傷等[20-22]，隨著對水蛭素研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗凝血、抗血栓形成以及抗氧化應(yīng)激等多重效用。牟忠祥等的研究結(jié)果表明，水蛭素組灌胃干預(yù)后的荷瘤鼠，其血清中SOD 水平明顯升高，提示自由基被清除后，脂質(zhì)過氧化過程受到阻斷，使水蛭素組荷瘤鼠丙二醛含量下降[23]。郭應(yīng)信等對大鼠隨意皮瓣淤血模型的試驗結(jié)果表明，水蛭素能提高淤血皮瓣局部SOD水平，減少丙二醛含量，減輕局部炎癥反應(yīng)[24]。Ou 等研究發(fā)現(xiàn)水蛭素可以清除晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)ROS，上調(diào)SOD水平[25-26]。添加0.08%水蛭素對冷凍前后豬精液SOD活性有升高作用，但影響不顯著。這與其他研究結(jié)果部分相似，都說明水蛭素有清除ROS、升高SOD活性的作用，只是本結(jié)果不顯著，這可能是因為SOD無統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)及表示方法[17]。endprint

不含水蛭素的冷凍稀釋液顯著降低了新鮮豬精液SOD活性，對SOD mRNA表達(dá)亦有降低影響，說明不含水蛭素的冷凍稀釋液對新鮮精液有一定的抑制作用，猜測可能是由于冷凍稀釋液中含有Tris，其為弱堿，具有刺激性，能夠抑制酶活性[27]。

4 結(jié)論

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加0.08%水蛭素對冷凍前后豬精液SOD活性及mRNA表達(dá)影響不顯著。

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