長(zhǎng)吻精子超低溫冷凍保存

采克俊　周志金　曹訪　朱俊杰　李景芬　葉金云

摘要：以精子活力為研究指標(biāo)，比較二甲亞砜、甘油、甲醇、乙二醇、丙二醇、乙二醇甲醚6種不同抗凍劑、平衡時(shí)間、熏蒸高度對(duì)長(zhǎng)吻（Leiocassis longirostris）精子超低溫冷凍保存的影響。防凍液組合為：10%乙二醇甲醚/HBSS條件下平衡30 min，熏蒸高度為11 cm時(shí)，長(zhǎng)吻的凍精活力最高。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)吻；精子；超低溫冷凍保存；活力；平衡時(shí)間；熏蒸高度；乙二醇甲醚

中圖分類號(hào)： S961.2+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0290-02

魚類種質(zhì)資源是進(jìn)行優(yōu)良苗種培育、遺傳改良和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物種基礎(chǔ)[1]，而由于環(huán)境惡化以及人類的過度捕撈等原因，導(dǎo)致魚類種質(zhì)資源匱乏。目前，超低溫冷凍保存是保存物種的有效方式[2]。由于魚卵和胚胎體積大、卵膜通透性差、卵黃含量高、含水量多、冷凍保存不易，相比之下，魚類精子的超低溫冷凍保存更易成功[1-3]。長(zhǎng)吻（Leiocassis longirostris）作為一種新近開發(fā)的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]，其精子冷凍保存未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此筆者進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚均來自當(dāng)?shù)赜鐖?chǎng)，選取健康狀況良好、體表無傷、無病且性成熟的魚類作為試驗(yàn)魚。

1.2 試驗(yàn)藥品與試劑

6種抗凍劑二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、甘油（glycerol，Gly）、乙二醇（ethylene glycol，EG）、丙二醇（propylene glycol，PG）、乙二醇甲醚（methoxyethanol，MG）、甲醇（methanol，MeOH）購于Amresco公司，其他藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3 稀釋液的配制

HBSS（漢克平衡鹽溶液）的配制：用電子天平稱取7.896 g NaCl、0.396 g KCl、0.195 g MgSO4·7H2O、0.072 g Na2HPO4·12H2O、0.054 g KH2PO4、0.345 g NaHCO3、0.99 g 葡萄糖，溶于1 000 mL純水中[5]。

1.4 方法

1.4.1 精液采集 選取性成熟的雄性親魚，剖腹取精巢，將精巢剪碎，添加試驗(yàn)所用的稀釋液稀釋，用干燥的過濾漏斗將所需的精液過濾，放在Eppendorf 管中并立即置于4 ℃冰箱內(nèi)，防止精子活力下降。

1.4.2 精子質(zhì)量活力的檢測(cè) 精液外觀質(zhì)量檢查：乳白色，無血污和糞便污染。在載玻片上滴10 μL純水，取5 μL鮮精于純水中，立即用顯微鏡觀察其活力，快速運(yùn)動(dòng)的精子記錄為活精子：精子活力=運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/全部的精子數(shù)×100%。鮮精活力在85%以上的精液才用于試驗(yàn)。

1.4.3 精子冷凍保存篩選

1.4.3.1 不同抗凍劑及其濃度對(duì)精子冷凍保存的影響 選取6種抗凍劑，添加濃度為5%、10%，稀釋液為HBSS，精液與防凍液稀釋比為1 ∶ 2，混合液分裝至麥管中，每支麥管裝100 μL，在4 ℃冰箱內(nèi)平衡30 min，平衡結(jié)束后在液氮上方7 cm 處熏蒸10 min，熏蒸結(jié)束后倒入液氮中保存；解凍時(shí)在37 ℃水浴中解凍6 s，用100單位滲透壓HBSS激活后，在顯微鏡下檢測(cè)凍精活力。篩選結(jié)果顯示，10% DMSO和10%乙二醇甲醚的冷凍保存效果較佳。

1.4.3.2 不同平衡時(shí)間對(duì)精子冷凍保存的影響 4 ℃平衡時(shí)間設(shè)定為5、15、30、45、60、75 min，選取的防凍液為10% DMSO/HBSS和10% 乙二醇甲醚/HBSS。

1.4.3.3 液氮熏蒸高度對(duì)精子冷凍保存的影響 稀釋液選用HBSS，抗凍劑選用10% HBSS和10% 乙二醇甲醚。熏蒸高度分別為3、5、7、9、11 cm；熏蒸結(jié)束后倒入液氮中保存，保存5 min后在37 ℃水浴中解凍6 s；用100單位滲透壓的 HBSS 激活，在顯微鏡下檢測(cè)凍精活力。

1.4.3.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；數(shù)據(jù)分析使用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way，ANOVA），P

2 結(jié)果與分析

2.1 不同防凍劑及其濃度對(duì)長(zhǎng)吻精子冷凍保存的影響

不同防凍劑及其濃度對(duì)長(zhǎng)吻精子冷凍保存的影響如圖1所示。在熏蒸高度為7 cm、平衡時(shí)間為30 min的條件下，當(dāng)滲透性防凍劑濃度為5%時(shí)，乙二醇甲醚對(duì)長(zhǎng)吻精子的冷凍保存作用最佳，長(zhǎng)吻凍精活力達(dá)35.00%±4.47%；當(dāng)滲透性防凍劑濃度為10%時(shí)，作用效果最好的是DMSO，精子活力達(dá)（45.00±4.47）%。所以，篩選出來的最佳防凍液為

10%DMSO+HBSS和10%乙二醇甲醚+HBSS。

2.2 不同防凍劑和熏蒸高度對(duì)長(zhǎng)吻精子冷凍保存的影響

不同防凍劑和熏蒸高度對(duì)長(zhǎng)吻精子冷凍保存的影響如圖2所示。在防凍液組合為10%DMSO+HBSS、熏蒸高度為7 cm時(shí)，長(zhǎng)吻的凍精活力最高，為（49.00±3.19）%；在防凍液組合為10%乙二醇甲醚+HBSS、熏蒸高度為11 cm時(shí)，長(zhǎng)吻的凍精活力最高，為（52.00±4.32）%。

2.3 不同防凍劑和平衡時(shí)間對(duì)長(zhǎng)吻精子冷凍保存的影響

不同防凍劑和平衡時(shí)間對(duì)長(zhǎng)吻精子冷凍保存的影響如圖3所示。在防凍液組合為10%DMSO+HBSS、熏蒸高度為7 cm、平衡時(shí)間為30 min時(shí)，長(zhǎng)吻的凍精活力最高，為（40.00±3.16）%；在防凍劑組合為10%乙二醇甲醚+HBSS、熏蒸高度為11 cm、平衡時(shí)間30 min時(shí)，長(zhǎng)吻的凍精活力最高，為（43.00±5.16）%。

3 結(jié)論與討論endprint

長(zhǎng)吻是一種名貴的淡水經(jīng)濟(jì)魚[6]，主要分布于長(zhǎng)江流域，而隨著人類的需求日益增加和過度捕撈，導(dǎo)致其資源量迅速銳減[6]。目前規(guī)模化苗種生產(chǎn)單位多采用解剖精巢取精的方式進(jìn)行人工授精，但繁殖效率依然不高，開展精子超低溫冷凍保存研究不僅可以極大地促進(jìn)長(zhǎng)吻工授精研究，而且對(duì)于魚類資源保護(hù)和遺傳改良具有重要意義。

超低溫冷凍保存，能夠使精子的運(yùn)動(dòng)完全停止，保證生命以靜止的狀態(tài)保存下來[3，7-8]，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。在冷凍之前，魚類精子必須先保存于防凍液中，因此篩選防凍液是魚類精子冷凍保存中的一個(gè)重要步驟，也是研究最多的一個(gè)領(lǐng)域。防凍液由稀釋液和抗凍劑組成，報(bào)道的魚類精子冷凍的稀釋液已經(jīng)多達(dá)幾十種[8]，本研究以HBSS為稀釋液，HBSS滲透壓為300 mOsm/kg，屬于等滲[5]。在相關(guān)長(zhǎng)吻精子的人工授精報(bào)道中，精子保存液滲透壓接近380 mOsm/kg[9]，與本試驗(yàn)采用的300 mOsm/kg的HBSS相差較大。因此，還需要進(jìn)一步研究稀釋液的滲透壓對(duì)長(zhǎng)吻精液冷凍保存的影響。

加入適當(dāng)?shù)目箖鰟?，可以提高精子滲透壓，降低冰點(diǎn)，有效減少精子冷凍保存過程中帶來的冰晶損傷。由于抗凍劑本身對(duì)細(xì)胞有毒害作用，而不同種類的魚類精子的生理特性具有很大差異。因此，確定最適的抗凍劑種類和濃度非常重要[3，7-8]。DMSO因其高滲透性和易與精子膜上磷脂層發(fā)生相互作用而被廣泛應(yīng)用于多種魚類精子冷凍[8]，通常當(dāng)其濃度達(dá)到10%時(shí)對(duì)魚類精子的冷凍保存效果最佳，此外本研究還發(fā)現(xiàn)乙二醇甲醚的效果較好。

滲透性抗凍劑滲入精子需要一段時(shí)間，因此在冷凍之前，將精液置于4 ℃下平衡一段時(shí)間對(duì)魚類精子冷凍非常。低溫有利于減小抗凍劑對(duì)精子的毒性，也有利于精子對(duì)冷凍環(huán)境的適應(yīng)。一般魚類精子的平衡時(shí)間多控制在10～60 min之間[2，8]。對(duì)于長(zhǎng)吻精子冷凍，最佳平衡時(shí)間都為30 min。

慢速降溫法有利于魚類精子對(duì)低溫的適應(yīng)，能在凍結(jié)前充分脫水，減少冰晶形成，安全越過-15～-60 ℃這段危險(xiǎn)溫度區(qū)；但是如果降溫速率太慢，精子就會(huì)長(zhǎng)時(shí)間處于高滲溶液中，導(dǎo)致細(xì)胞收縮，出現(xiàn)溶質(zhì)損傷，因此應(yīng)篩選適宜的熏蒸高度對(duì)精子進(jìn)行冷凍保存。結(jié)果表明，當(dāng)熏蒸高度為11 cm且防凍液為10%乙二醇甲醚時(shí)，精子冷凍保存效果最佳。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳松林. 魚類配子和胚胎冷凍保存研究進(jìn)展及前景展望[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2002，26（2）：161-168.

[2]陳松林. 魚類精子和胚胎冷凍保存理論與技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[3]Robles V，Cabrita E，Paz H M. Germplasm cryobanking in zebrafish and other aquarium model species[J]. Zebrafish，2009，6（3）：281-293.

[4]宋信華. 長(zhǎng)吻人工繁殖技術(shù)[J]. 漁業(yè)致富指南，2002（3）：39-40.

[5]Huang C J，Sun C L，Su X Y，et al. Sperm cryopreservation in guppies and black mollies-a generalized freezing protocol for livebearers in Poeciliidae[J]. Cryobiology，2009，59（3）：351-356.

[6]陳 萍. 長(zhǎng)吻人工高產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（22）：317，319.

[7]Cabrita E，Sarasquete C，Martinez-Paramo S，et al. Cryopreservation of fish sperm：applications and perspectives[J]. Journal of Applied Ichthyology，2010，26（5）：623-635.

[8]采克俊，曹 訪，葉金云. 魚類精子低溫冷凍保存研究進(jìn)展[J]. 湖州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，34（2）：26-30.

[9]萬 全，沈保平，孫文賢，等. 長(zhǎng)吻精子保存液在人工授精中的應(yīng)用試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，2006，27（3）：4-6.羅慶華，謝 堅(jiān)，李 捷，等. 全球變化背景下中國大鯢生態(tài)繁育工程的結(jié)構(gòu)與功能分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：292-295.endprint