付亞娟　喬潔　侯曉強(qiáng)

摘要：大花杓蘭是珍稀瀕危藥用植物，大花杓蘭資源的保護(hù)和再生引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。為及時(shí)把握大花杓蘭的研究現(xiàn)狀和最新研究成果，以1997—2014年國內(nèi)外關(guān)于大花杓蘭的研究論文為基礎(chǔ)，對(duì)其基礎(chǔ)生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、授粉生物學(xué)、植物菌根共生機(jī)制、瀕危機(jī)制、保護(hù)策略等方面的研究成果進(jìn)行總結(jié)與分析。

關(guān)鍵詞：大花杓蘭；人工繁殖；研究現(xiàn)狀

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0328-04

大花杓蘭（Cypripedium macranthos）是蘭科杓蘭屬的多年生草本植物。近年來，由于人為過度采挖及其生存環(huán)境的破壞，致使大花杓蘭野生種群的數(shù)量急劇減少，總體處于瀕危狀態(tài)[1]。大花杓蘭極具觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，其研究引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。大花杓蘭種子細(xì)小，缺乏為其萌發(fā)提供營養(yǎng)的器官-胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)。只有在適宜的溫度、濕度等條件下，遇到特異的真菌并與之建立共生關(guān)系才能促進(jìn)種子萌發(fā)[2]。目前，大花杓蘭種子的非共生萌發(fā)、與真菌共生萌發(fā)、快速繁殖技術(shù)已取得一定進(jìn)展，但仍處于少量微繁殖（micropropagation）階段，其原因在于原球莖誘導(dǎo)率低、褐化死亡率高、幼苗生長緩慢、幼苗移栽成活率低。以1997—2014年國內(nèi)外發(fā)表的研究論文為基礎(chǔ)，對(duì)大花杓蘭的研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析和評(píng)述，有助于及時(shí)了解和掌握我國大花杓蘭的研究水平、優(yōu)勢(shì)、不足，對(duì)豐富與拓展大花杓蘭的研究領(lǐng)域具有重要意義。

1 文獻(xiàn)來源及方法

通過中文期刊數(shù)據(jù)庫（CNKI），以“大花杓蘭”為檢索詞進(jìn)行全文檢索，獲得1997—2014年關(guān)于大花杓蘭的中文文獻(xiàn)；通過NCBI PubMed、Science Direct、Springerlinker外文期刊數(shù)據(jù)庫，以“Cypripedium macranthos”為檢索詞檢索1997—2014年關(guān)于大花杓蘭的外文文獻(xiàn)，并去掉3個(gè)數(shù)據(jù)庫中重復(fù)的論文。采用Excel軟件進(jìn)行文獻(xiàn)相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

2 大花杓蘭的研究概況及主要研究方向

自1997—2014年18年期間，國內(nèi)外學(xué)者共發(fā)表大花杓蘭研究論文31篇，其中中文期刊論文17篇、SCI收錄論文14篇。研究論文發(fā)表數(shù)量較少，表明大花杓蘭的研究剛剛起步，基礎(chǔ)較為薄弱。在SCI論文中，日本學(xué)者發(fā)表多達(dá)11篇，中國學(xué)者發(fā)表2篇，韓國學(xué)者僅發(fā)表1篇，表明大花杓蘭的研究主要以日本、我國為主，這與大花杓蘭自然分布于俄羅斯、朝鮮半島、我國、日本[3]密切相關(guān)。自2009年后，我國學(xué)者在國內(nèi)外刊物發(fā)表大花杓蘭研究論文的數(shù)量不斷增加，目前為止共發(fā)表論文19篇，其中SCI收錄2篇，表明我國大花杓蘭的研究起步更晚，近10年才引起普遍關(guān)注并處于平穩(wěn)發(fā)展時(shí)期。華北和東北是我國大花杓蘭的主要分布區(qū)[4]，因此我國的研究以北京百花山、吉林長白山的大花杓蘭為主。對(duì)31篇論文的研究內(nèi)容進(jìn)一步分析表明，關(guān)于大花杓蘭體外人工繁殖的研究最多，約占論文總數(shù)的39%；其次是關(guān)于大花杓蘭葉片、表皮、胚、珠被、種子、花粉的形態(tài)研究，約占論文總數(shù)的19%；隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和大花杓蘭研究的不斷深入，關(guān)于大花杓蘭的遺傳多樣性、內(nèi)生真菌多樣性、植物-菌根真菌共生機(jī)制等方面的研究也日益廣泛。

3 大花杓蘭的研究進(jìn)展

大花杓蘭具有重要的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值、科學(xué)研究價(jià)值，并具有廣泛的應(yīng)用潛力。本研究對(duì)大花杓蘭的生物學(xué)、繁殖生物學(xué)、傳粉生物學(xué)、菌根共生機(jī)理、瀕危機(jī)制、保護(hù)策略等方面進(jìn)行論述，以展示近年來大花杓蘭的主要研究成果。

3.1 基礎(chǔ)生物學(xué)研究

我國學(xué)者對(duì)野生花卉、蘭科植物資源、瀕危保護(hù)植物資源、觀賞植物資源等進(jìn)行野外調(diào)查時(shí)均有提及大花杓蘭，主要涉及其分布、生境、花色、數(shù)量、花期、果期等[5-11]。大花杓蘭是我國北方溫帶地生蘭的典型代表物種，主要分布于高山草甸、林下、林間草甸、林緣，因過度采集和生態(tài)環(huán)境的破壞，野生資源幾近枯竭，成零星狀態(tài)分布。大花杓蘭極具觀賞價(jià)值，花期為6—7月，通常為粉紫色或紫紅色。經(jīng)野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，吉林長白山區(qū)天橋嶺的大花杓蘭花色多樣性較高，具有純黃色、純白色、從紅色漸變?yōu)榘咨亩喾N花色。Sugiura等對(duì)日本Ruben島的大花杓蘭進(jìn)行野外調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ruben島大花杓蘭基本為黃白色或白色，紫紅色大花杓蘭非常罕見[12]。

陳麗飛等對(duì)長白山地區(qū)大花杓蘭的葉片表皮細(xì)胞、成熟種子、花粉的微形態(tài)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其葉片表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞垂周壁呈深波狀，圓形或近圓形氣孔隨機(jī)分布于下表皮，葉片表皮有4節(jié)柔毛[13]；其種子呈長卵形，種皮表面有淺褐色網(wǎng)狀條紋，網(wǎng)紋多為矩形，網(wǎng)壁邊緣粗糙或光滑[14]；其花粉呈長球形，表面有圓形凹陷，凹陷內(nèi)部有1個(gè)球形內(nèi)容物，未見明顯萌發(fā)孔，花粉外壁有光滑的外壁紋飾[15]。張毓等研究發(fā)現(xiàn)，授粉6周后的大花杓蘭種胚發(fā)育至球形胚，之后沒有進(jìn)一步分化，直至種子成熟仍保留球形胚形態(tài)，且成熟種子具有內(nèi)外雙層種皮[16]。由此可見，致密干膜質(zhì)內(nèi)種皮可能是大花杓蘭對(duì)自然環(huán)境的一種保護(hù)性適應(yīng)，也可能是造成其成熟種子萌發(fā)困難的主要原因。

3.2 繁殖生物學(xué)研究

大花杓蘭具有克隆生長習(xí)性，可通過分株進(jìn)行無性繁殖，但1株大花杓蘭成株每年只能長出為數(shù)不多的潛伏芽，繁殖系數(shù)較低。此外，長期分株繁殖可能導(dǎo)致品種退化，抗病蟲害能力下降。人工繁殖、栽培、引種馴化等技術(shù)可以克服分株無性繁殖的不足，并能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量再生植株。

3.2.1 共生萌發(fā)及繁殖 國內(nèi)外學(xué)者對(duì)大花杓蘭種子-真菌共萌發(fā)技術(shù)展開研究并取得了一定進(jìn)展。目前已證實(shí)，對(duì)大花杓蘭種子共生萌發(fā)有促進(jìn)作用的菌根真菌均屬于瘤菌根菌屬（Epulorhiza）。從C. macranthos var. rebunense成株分離得到的菌根真菌WO97、WO034、WC035促萌發(fā)率最高，分別為21.1%、20.9%、24.1%；從幼苗、原球莖分離得到的菌根真菌促萌發(fā)率較低，為0.6%～6.6%；從C. macranthos var. speciosum分離得到的菌根真菌也能促進(jìn)C. macranthos var. rebunense種子萌發(fā)，但萌發(fā)率較低，僅為1.1%～4.2%；其他蘭科植物的共生真菌Rhizoctonia repens對(duì)C. macranthos var. rebunense種子萌發(fā)沒有任何促進(jìn)作用[17]。在不同生長發(fā)育階段，宿主植物與其共生真菌對(duì)種子的促萌發(fā)能力存在明顯差異，并具有種屬特異性。張毓等從吉林長白山野生大花杓蘭的根中分離得到1株瘤菌根菌屬的真菌Cm-J-R-2，并證實(shí)該菌株能很好地促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)，平均萌發(fā)率為29.34%[18]。大花杓蘭與共生真菌之間有很高的專一性，且已證實(shí)對(duì)大花杓蘭種子有促萌發(fā)作用的菌根菌均為瘤菌根菌屬真菌，共生真菌對(duì)種子的促萌發(fā)率基本穩(wěn)定在 20%～30%。endprint

3.2.2 非共生無菌萌發(fā)及繁殖 非共生無菌萌發(fā)是目前蘭花種子人工繁育中最為常用的方式。Miyoshi等研究發(fā)現(xiàn)，將NaClO或Ca（ClO）2處理、4 ℃冷處理打破種子休眠、細(xì)胞分裂素Kinetin（1 μM）三者有效結(jié)合可使大花杓蘭成熟種子的萌發(fā)率達(dá)到60%～70%[19]。Shimura等成功建立了C. macranthos var. rebunense的微繁殖技術(shù)：成熟種子經(jīng)1%NaClO消毒30～60 min后播種于含有1 μmol/L NAA和BA的培養(yǎng)基中；4 ℃冷處理3個(gè)月以解除種子休眠；轉(zhuǎn)至20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)形成類原球莖的愈傷組織；每個(gè)直徑為5 mm的類原球莖每年可再生約10株幼苗；幼苗經(jīng)低溫馴化（10 ℃ 1個(gè)月，4 ℃ 2個(gè)月）后移栽到花盆中（栽培基質(zhì)為粗火山灰和黏土），約80%幼苗能較好地發(fā)育并長出新葉子[20]。Taniguchi等研究發(fā)現(xiàn)，C. macranthos var. rebunense未成熟種子萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為T培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基[21]。適宜的人工培養(yǎng)條件（溫度、濕度、培養(yǎng)成分、光照），加上種子和幼苗數(shù)次4 ℃冷處理，使人工繁殖的C. macranthos var.rebunense第1朵花在溫室里盛開，從種子萌發(fā)到開花歷時(shí)7年。王艷麗等以移栽2年的野生大花杓蘭未開裂的黃綠色蒴果種子進(jìn)行組織培養(yǎng)與快速繁殖，種子在Harvais、VWD培養(yǎng)基上萌發(fā)形成白色原球莖，原球莖分化誘導(dǎo)出芽、根后，選擇高度 1.5 cm 以上、根系發(fā)達(dá)、長勢(shì)良好的幼苗移入移栽基質(zhì)（珍珠巖、蛭石、草炭灰、樹葉的比例為1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1）中，精心呵護(hù)1個(gè)月后幼苗成活率達(dá)70%以上[22]，但種子萌發(fā)率、原球莖誘導(dǎo)分化率、幼苗生長率、是否開花結(jié)實(shí)均未提及。張毓等研究發(fā)現(xiàn)，大花杓蘭未成熟綠莢種子（種胚發(fā)育形成球形胚，但內(nèi)種皮未形成干膜前）在VW改良培養(yǎng)基（2.0 mg/L 6-BA）上培養(yǎng)，萌發(fā)率高達(dá)60.54%[23]。鄧蓮等研究發(fā)現(xiàn)，大花杓蘭（北京百花山）授粉后6～8周，種子萌發(fā)率明顯高于幼嫩或成熟種子；在VWD改良培養(yǎng)基上培養(yǎng)，種子萌發(fā)率高達(dá)68%；1.2 mg/L KT是既能促進(jìn)大花杓蘭種子萌發(fā)，又能維持原球莖低褐化率的適宜激素濃度；有機(jī)添加物（如100 mL/L椰乳或馬鈴薯）有利于大花杓蘭種子的萌發(fā)[24]。樸仁哲等對(duì)吉林長白山移栽2年的野生大花杓蘭進(jìn)行人工輔助授粉，并以授粉13周后的半成熟種子為試驗(yàn)材料，從種子處理、培養(yǎng)基、生長激素等方面探討大花杓蘭無菌萌發(fā)。研究結(jié)果表明，經(jīng)0.5%NaClO處理160 min的種子萌發(fā)率最高，可達(dá)68%以上；最適培養(yǎng)基為Harvais培養(yǎng)基，最適pH值為5.5～5.8；6-BA對(duì)種子的促進(jìn)萌發(fā)效果明顯優(yōu)于KT；添加馬鈴薯、蘋果均可促進(jìn)大花杓蘭種子的無菌萌發(fā)，但馬鈴薯的促萌發(fā)效果更為明顯[25]。

NaClO濃度、作用時(shí)間、低溫預(yù)處理、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、激素、有機(jī)添加物對(duì)大花杓蘭種子的無菌萌發(fā)均有一定影響，但低溫預(yù)處理、有機(jī)添加物并非無菌萌發(fā)所必需的。成熟種子和未成熟種子均可在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行無菌萌發(fā)，且萌發(fā)率高達(dá)60%左右，明顯高于萌發(fā)率僅為20%～30%的共生萌發(fā)。種子的無菌萌發(fā)也有一定局限性，未成熟的種子不耐儲(chǔ)存，采摘后須立即試驗(yàn)，1年只有1次試驗(yàn)機(jī)會(huì)，且未成熟種子的最佳采摘時(shí)期不易把握。

3.3 傳粉生物學(xué)研究

Sugiura等對(duì)日本Ruben島分布的大花杓蘭進(jìn)行野外資源調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，熊蜂的蜂王是大花杓蘭唯一的傳粉者，同時(shí)也是馬先蒿（Pedicularis schistostegia）的傳粉者；大花杓蘭與馬先蒿花色相同，且花期重疊，在野外生境混生，但大花杓蘭出現(xiàn)的頻率相對(duì)較低；覓食的熊蜂有時(shí)會(huì)混淆大花杓蘭和馬先蒿；大花杓蘭和馬先蒿在空間分布上有很大程度的重疊，臨近2個(gè)植物的植株高度基本一致；大花杓蘭和馬先蒿的淡黃色、白色花朵恰在大黃蜂的可見光譜范圍內(nèi)[12，26]。上述研究發(fā)現(xiàn)表明，C. macranthos var. rebunense通過擬態(tài)伴生植物馬先蒿來引誘熊蜂傳粉，其傳粉機(jī)制完全不同于杓蘭[27]（Cypripedium calceolus）等杓蘭屬的其他種類，這可能是適應(yīng)環(huán)境變化的一種進(jìn)化機(jī)制。

3.4 菌根共生機(jī)理

菌根真菌與蘭科植物的關(guān)系十分密切，蘭科植物的種子萌發(fā)、幼苗生長、植株形成都離不開菌根真菌。在自然條件下，大花杓蘭種子不易萌發(fā)，需依賴真菌的侵染并與其建立共生關(guān)系，才能促進(jìn)種子的萌發(fā)。目前，大花杓蘭與菌根菌的共生機(jī)制尚不明確，似乎與其他陸生植物和菌根菌之間的互惠共生關(guān)系不同，而是生與死（life-and-death）的斗爭關(guān)系[28]。Shimura等從大花杓蘭幼苗中分離鑒定了2種抗菌活性物質(zhì)lusianthrin和chrysin，并證實(shí)lusianthrin在大花杓蘭種子與真菌共生萌發(fā)過程中起著重要作用，而chrysin作為植物抗毒素保護(hù)大花杓蘭免受病原菌侵害[28]。開花成株的大花杓蘭菌根真菌分離率明顯高于其幼苗和原球莖，且成株分離到的菌根真菌更能有效促進(jìn)種子萌發(fā)[17]。張亞平對(duì)吉林地區(qū)大花杓蘭不同生長發(fā)育階段的內(nèi)生真菌分布進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)開花植株在萌芽期、展葉期的內(nèi)生真菌分離率分別為34.52%、55.95%，而開花期內(nèi)生真菌分離率僅為4.00%左右[29]?？赡苁巧成系牟町愒斐闪舜蠡ㄨ继m不同的共生營養(yǎng)模式，從而造成二者結(jié)果的差異。張亞平首次報(bào)道，分離鑒定的3株雞油菌目（Cantharellales）內(nèi)生真菌均能極顯著提高原球莖的花芽分化率，并能降低褐化死亡率，促進(jìn)大花杓蘭原球莖的生長和發(fā)育。在整個(gè)生命周期中，大花杓蘭可能與不同真菌建立共生關(guān)系并產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，有些抗菌活性物質(zhì)將參與大花杓蘭種子與真菌的共生萌發(fā)。上述研究結(jié)果為大花杓蘭菌根共生的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

3.5 瀕危機(jī)制及保育策略endprint

大花杓蘭的野生種群逐漸衰退，數(shù)量急劇減少，處于瀕危狀態(tài)。大花杓蘭瀕危的主要原因并非其對(duì)現(xiàn)有自然環(huán)境的不適應(yīng)，而是人類活動(dòng)導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境破壞以及非法濫采亂挖所致[30]。林大影通過對(duì)北京瀕危植物的分布及其生存群落特征的研究，計(jì)算出大花杓蘭的生態(tài)位寬度為0.024，表明適于其生存的生境較少，急需優(yōu)先保護(hù)[31]。為更好地保護(hù)、研究、開發(fā)利用大花杓蘭植物資源，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其開展了人工繁殖、引種馴化及相關(guān)的基礎(chǔ)性研究，并提出一些保育策略：加強(qiáng)植物生境的保護(hù)；制定和完善相關(guān)法律法規(guī)，加強(qiáng)宣傳教育，提高社會(huì)公眾保護(hù)生物多樣性的自覺意識(shí)；建立植物資源數(shù)據(jù)庫，開展就地保護(hù)和監(jiān)測(cè)；注重科研院所與高校合作研究，加強(qiáng)科研攻關(guān)，進(jìn)行大花杓蘭植物傳粉、種子擴(kuò)散等機(jī)理研究，從而提供合理的保護(hù)措施；遷地保護(hù)或離體保護(hù)；人工輔助進(jìn)行種子原位就地播種[8，10，32-34]。

3.6 其他方面

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大花杓蘭的研究領(lǐng)域得以不斷拓展。Izawa等應(yīng)用等位酶標(biāo)記技術(shù)對(duì)日本Ruben島分布的大花杓蘭野生種群進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)C. macranthos var.rebunense比其他植物類群具有更高的遺傳多樣性[34]。蔣明等克隆并分析了10種杓蘭屬植物的ITS序列，序列長度為522～572 bp，變異位點(diǎn)十分豐富，其中高山杓蘭和大花杓蘭的ITS片段缺失現(xiàn)象尤為明顯[35]。2014年，大花杓蘭葉綠體基因組（登錄號(hào)：KF92543）的測(cè)序工作已完成，豐富了蘭科植物葉綠體基因組的多樣性[36]。這些研究結(jié)果為蘭科植物遺傳多樣性、分子系統(tǒng)發(fā)育的研究奠定了理論基礎(chǔ)，對(duì)制定合理的大花杓蘭保護(hù)策略具有指導(dǎo)意義。另外，秦瑀研究證實(shí)了大花杓蘭的水提醇液具有利尿作用[37]，但其藥用化學(xué)成分的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定有待進(jìn)一步深入研究。

4 展望

目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)大花杓蘭人工繁殖及其應(yīng)用的研究已取得一定進(jìn)展，但由于其褐化率死亡率高、幼苗生長緩慢等研究瓶頸尚未突破，致使大花杓蘭人工繁殖至今仍處于少量微繁殖階段。大花杓蘭是珍稀瀕危國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物，其研究材料的相對(duì)匱乏導(dǎo)致國內(nèi)外對(duì)大花杓蘭內(nèi)生菌多樣性、菌根真菌的生理生化特性，尤其是大花杓蘭-菌根真菌共生分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)十分有限，一定程度上限制了大花杓蘭菌根化應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ITS和DNA條形碼技術(shù)等已被應(yīng)用于大花杓蘭遺傳多樣性的研究中[38]，為今后大花杓蘭的原地或遷地保育提供理論基礎(chǔ)。

從國內(nèi)外發(fā)表的大花杓蘭期刊論文來看，大花杓蘭的研究起步較晚且發(fā)展緩慢，很多領(lǐng)域有待進(jìn)一步深入研究。鑒于我國大花杓蘭的研究現(xiàn)狀、應(yīng)用價(jià)值、開發(fā)利用前景，對(duì)我國未來大花杓蘭的研究提出如下建議：全面開展大花杓蘭植物資源的現(xiàn)狀調(diào)查，系統(tǒng)了解其分布、生境、數(shù)量、生長及繁殖狀況，深入開展生態(tài)學(xué)、居群生物學(xué)等基礎(chǔ)性研究，為制定合理、有針對(duì)性的保育策略提供理論基礎(chǔ)。應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)、RT-PCR、RACE方法等強(qiáng)有力的技術(shù)手段，篩選參與共生萌發(fā)的關(guān)鍵候選基因，為深入研究大花杓蘭植物菌根共生的分子機(jī)理提供科學(xué)線索。建立優(yōu)良菌株的篩選、培養(yǎng)、評(píng)價(jià)體系，篩選能有效促進(jìn)大花杓蘭植物種子萌發(fā)、原球莖分化、幼苗生長發(fā)育的菌根真菌，為應(yīng)用菌根共生技術(shù)實(shí)現(xiàn)大花杓蘭植物資源的保護(hù)和規(guī)?；敝车於ɑA(chǔ)。結(jié)合DNA條形碼技術(shù)、野外生態(tài)學(xué)開展人工繁殖大花杓蘭“回歸自然”的相關(guān)研究，這是緩解大花杓蘭瀕危程度、恢復(fù)其野生種群最為直接有效的技術(shù)手段，也是深入開展其他研究工作的重要基礎(chǔ)。

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