龍葵對(duì)鎘污染土壤的響應(yīng)及其修復(fù)效應(yīng)研究

孫正國(guó)

摘要：以礦區(qū)不同范圍內(nèi)（對(duì)照組、市內(nèi)、礦區(qū)周邊農(nóng)田、礦區(qū)邊緣、礦區(qū)和尾礦）土壤為培養(yǎng)基質(zhì)盆栽重金屬超富集植物龍葵（Solanum nigrum），研究其對(duì)鎘污染土壤修復(fù)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同樣地土壤含鎘量不同，土壤中鎘含量（Cd >20 mg/kg）遞增對(duì)龍葵生長(zhǎng)和光合作用產(chǎn)生明顯負(fù)面影響，如生物量遞減、光合效率降低。其次，龍葵在鎘污染土壤的脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）含量增加。此外，土壤中鎘含量的增加龍葵中與鎘轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因表達(dá)水平也顯著增加。以上結(jié)果表明，過(guò)量的鎘對(duì)龍葵的生長(zhǎng)發(fā)育有負(fù)面影響，促進(jìn)植物體有害物質(zhì)（過(guò)氧化物和MDA）的積累，同時(shí)龍葵自身也通過(guò)合成相關(guān)的酶清除體內(nèi)有害物質(zhì)，減輕損害，如通過(guò)快速合成相關(guān)鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，增強(qiáng)龍葵對(duì)土壤中鎘的吸收和積累，從而減少土壤中鎘的含量。

關(guān)鍵詞：龍葵；鎘污染；有害物質(zhì)積累；基因表達(dá)；Real-time PCR；光合作用；抗氧化酶

中圖分類(lèi)號(hào)： X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0397-05

近十幾年來(lái)，我國(guó)金屬礦山開(kāi)采高速發(fā)展，礦山周邊土壤受到重金屬污染日益嚴(yán)重[1-2]。造成土壤污染的重金屬主要包括As、Cd、Hg、Pb、Cu、Zn、Co、Mn、Ni、Cr等，其中鎘污染是最常見(jiàn)的重金屬污染之一，在土壤中具有較強(qiáng)的化學(xué)活性，與其他重金屬相比，更易被植物吸收，具有很強(qiáng)的從土壤向植物遷移的能力[3-6]。土壤中鎘含量過(guò)多將會(huì)使植物受到嚴(yán)重毒害，植物表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、褪綠等中毒癥狀，其細(xì)胞的膜透性、光合代謝、呼吸代謝、酶代謝、遺傳效應(yīng)等也發(fā)生改變，生物量下降[7-9]。如何消除土壤環(huán)境中的重金屬污染物已經(jīng)成為國(guó)際性難題。因此，20世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來(lái)的利用植物修復(fù)（phytoremediation）技術(shù)修復(fù)鎘污染土壤的研究逐漸成為研究熱門(mén)，相對(duì)于傳統(tǒng)的重金屬污染土壤治理方法，如換土法、淋洗法、化學(xué)氧化法等，植物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保綠色的優(yōu)勢(shì)，因而具有極大的潛力[10-12]。重金屬污染土壤的植物修復(fù)主要是指利用超富集植物（hyperaccu-mulator）的提取作用將土壤中超量的重金屬去除，從而達(dá)到清潔污染土壤的目的[13]。目前，香根草、續(xù)斷菊、蜈蚣草、鱗苔草、印度芥菜、龍葵等都是重金屬超富集型植物。龍葵作為新型重金屬超富集植物對(duì)鎘具有較強(qiáng)的耐受性，主要通過(guò)螯合作用，限制鎘的吸收和在植物體內(nèi)的運(yùn)輸，區(qū)域化以及相應(yīng)酶的解毒作用，也通過(guò)形成對(duì)鎘高度親和的高分子量絡(luò)合物或是調(diào)節(jié)相關(guān)重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)鎘的聚集和解毒。本試驗(yàn)以新型鎘超富集植物龍葵為材料，研究了不同濃度鎘污染土壤對(duì)龍葵植株生理生長(zhǎng)、抗氧化系統(tǒng)、光合作用等生理特性和鎘吸收積累特性的影響，探討了鎘脅迫下超富集植物龍葵的生理響應(yīng)機(jī)制以及龍葵對(duì)鎘污染土壤的修復(fù)基質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

銅山口礦區(qū)地處長(zhǎng)江中下游銅鐵成礦帶西端，位于湖北省大冶市境內(nèi)，屬于我國(guó)典型的露天開(kāi)采的中型銅礦，該礦床為矽卡巖斑巖復(fù)合型礦床。礦區(qū)坐標(biāo)是141°50′217″E、30°0′35″N。該礦床主要出產(chǎn)有色金屬礦Cu，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)夾含少量各類(lèi)重金屬，如As、Cd、Hg、Pb、Zn、Co、Mn、Ni、Cr等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 采集樣地及樣品理化性質(zhì)測(cè)定 2013年6月分別采集尾礦、礦區(qū)、礦區(qū)邊緣、礦區(qū)周邊農(nóng)田、大冶市內(nèi)以及對(duì)照土壤，樣品袋保存，于實(shí)驗(yàn)室分揀粗砂、枯枝爛葉等雜質(zhì)，自然風(fēng)干。pH值采用電極電位法測(cè)定（1 ∶ 2.5土水比）；土壤全氮（g/kg）用凱氏定氮法測(cè)定；土壤全磷（g/kg）用 NaOH 熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定；根莖葉果實(shí)中鎘含量用HNO3-H2O2微波消解（CEM MARS-5）-原子吸收法（TAS-990普析通用原子吸收分光光度計(jì)）測(cè)定，用植物樣本（GBW08510）進(jìn)行質(zhì)量分析；土壤中鎘含量用鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解-原子吸收法測(cè)定，用土壤標(biāo)樣（GBW08303）進(jìn)行質(zhì)量分析[14-16]。

1.2.2 龍葵光合及生理生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 2013年8月，用直尺測(cè)量并記錄龍葵株高；分別收獲龍葵根、莖、葉和果實(shí)，測(cè)量鮮質(zhì)量，并于120 ℃烘箱殺青2 h，再調(diào)至80 ℃烘烤48 h，分別稱(chēng)量干質(zhì)量。在龍葵培養(yǎng)期間，每隔1個(gè)月，用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500（Walz，德國(guó)） 進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)選取至少3張活體全葉葉片進(jìn)行暗適應(yīng)30 min，檢測(cè)時(shí)先用測(cè)量光（0.5 μmol/m2·s） 測(cè)定初始熒光Fo，飽和光脈沖2 700 μmol/（m2·s）（脈沖時(shí)間0.8 s）誘導(dǎo)Fm，光化光強(qiáng)度為186 μmol/（m2·s），主要測(cè)量能夠反映光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）活性的初始熒光強(qiáng)度（Fo）、最大原初始光能轉(zhuǎn)換效率（Fv/Fm）、最大電子傳遞速率（ETR），以及反映植物熱耗散能力的PSⅡ非光化學(xué)淬滅系數(shù)（qN）。

1.2.3 龍葵抗氧化系統(tǒng)酶活測(cè)定 參照李合生的方法[17]測(cè)定丙二醛（MDA）含量。超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定采用NBT光還原法，利用SOD對(duì)氮藍(lán)四唑（NBT）的光抑制作用，在560 nm處測(cè)定吸光度[18]。計(jì)算公式如下：

SOD活性（U/g）=樣品液體積×（對(duì)照管D-樣品管D）/對(duì)照管D加入酶液的量×50%樣品鮮質(zhì)量。

1.2.4 鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)變化 RNA提取：分別剪取新鮮的龍葵葉片，參考Q-Biogene 公司的RNA提取試劑盒（FastRNA Pro Green Kit） 提取RNA。

cDNA合成：參考Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Superscript Ⅱ）合成cDNA。

Real Time-PCR：參考Applied Biosystems 公司的Power Sybr Green PCR Master Mix（10 μL） 說(shuō)明，構(gòu)建反應(yīng)體系。PCR引物如表1。endprint

通過(guò) Real-time PCR 試驗(yàn)，得出所有基因的CT值。以 GAPDH 和 TUBULIN 基因?yàn)閮?nèi)參基因，計(jì)算出ΔCT。在市內(nèi)、礦區(qū)周邊農(nóng)田、礦區(qū)邊緣、礦區(qū)及尾礦龍葵基因表達(dá)的分析中，以 MT2A基因的表達(dá)為定標(biāo)。在對(duì)照組龍葵基因表達(dá)的分析中，以PCS基因?yàn)槎?biāo)。計(jì)算出ΔΔCT并作記錄，通過(guò)下列公式計(jì)算RQ：

RQ=2-ΔΔCT。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行顯著性分析。用OriginPro 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地土壤理化性質(zhì)

礦區(qū)不同區(qū)域內(nèi)土壤pH值差異顯著，總體上呈現(xiàn)越靠近礦區(qū)土壤pH值越小，酸度越大的趨勢(shì)（表2）。農(nóng)田中因農(nóng)作物生長(zhǎng)需要，認(rèn)為施肥較多，土壤中氮磷含量較其他地區(qū)差異顯著，對(duì)照組和市內(nèi)土壤之間，礦區(qū)外緣、礦區(qū)以及尾礦土壤之間氮磷含量差異都不顯著。不同區(qū)域土壤中重金屬鎘含量差異極顯著，其中礦區(qū)周邊農(nóng)田、礦區(qū)外緣、礦區(qū)及尾礦顯著超出國(guó)家土壤鎘含量最低三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（≤1.0 mg/kg）標(biāo)準(zhǔn)值，尾礦中的礦物經(jīng)處理后的殘?jiān)墟k含量更是高于標(biāo)準(zhǔn)值200倍，其礦區(qū)周邊的農(nóng)田土壤中鎘含量也超標(biāo)，受到污染。

2.2 龍葵生理生長(zhǎng)及光合特性

隨著供試土壤中鎘含量的增加，龍葵受到脅迫程度也在增加，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、高度變低、各部分生物量減小，尤其是礦區(qū)和尾礦土壤所栽培的龍葵株高及生物量較其他區(qū)域土壤栽培龍葵差異明顯 （表3）。同時(shí)，鎘含量的增加引起PSⅡ反應(yīng)系統(tǒng)中初始熒光水平（Fo）的增加，而最大原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、最大電子傳遞速率（ETR）明顯降低（圖1），說(shuō)明PSⅡ反應(yīng)系統(tǒng)遭受破壞或可逆失活。此外，植物捕光色素吸收光能后以熱的形式耗散過(guò)剩激發(fā)能的能力（qN）也明顯上升，說(shuō)明它們啟動(dòng)熱耗散來(lái)消耗過(guò)量的激發(fā)能，以減輕重金屬鎘脅迫對(duì)其光合系統(tǒng)的損傷。

2.3 龍葵對(duì)鎘的富集特性

經(jīng)過(guò)8個(gè)月的生長(zhǎng)，測(cè)定培養(yǎng)基質(zhì)土壤理化性質(zhì)，各區(qū)域土壤較采樣前土壤pH值，總氮磷含量變化不明顯，生長(zhǎng)過(guò)程中噴施霍格蘭式營(yíng)養(yǎng)液，氮磷含量略有變化，而各區(qū)域土壤中鎘含量有明顯減少，說(shuō)明這段時(shí)間內(nèi)土壤中鎘有轉(zhuǎn)移（表4）。再對(duì)龍葵各部分鎘含量進(jìn)行測(cè)定，龍葵中鎘含量明顯增加，說(shuō)明其吸收了土壤中的鎘并富集在植物的不同組織，根吸收水分和營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)也能吸附土壤當(dāng)中的鎘，再通過(guò)向上運(yùn)輸富集在營(yíng)養(yǎng)器官果實(shí)中，因此根和果實(shí)中富集鎘最多，葉莖次之，而且檢測(cè)發(fā)現(xiàn)龍葵對(duì)鎘的吸收多少可能和所生長(zhǎng)土壤當(dāng)中的鎘含量有顯著相關(guān)，當(dāng)土壤中鎘含量較高時(shí)，龍葵容易吸收富集更多的鎘（圖2）。

2.4 龍葵SOD和MDA的積累

土壤中的鎘含量達(dá)到一定的濃度時(shí)會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[19-22]，例如超氧化物 O-2 · 和過(guò)氧化氫（H2O2）等，同時(shí)植物會(huì)啟動(dòng)自身防御，產(chǎn)生多種抗氧化酶（如SOD），清除過(guò)氧化物[23-26]；還可能引起細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)多的MDA，毒害植物細(xì)胞[27]。在不同鎘含量土壤中生長(zhǎng)的龍葵MDA含量不同，呈現(xiàn)土壤中鎘含量越高，龍葵吸收鎘越多，產(chǎn)生的MDA越多，對(duì)植物毒害越大（圖3）。在對(duì)不同土壤中生長(zhǎng)龍葵細(xì)胞內(nèi)SOD活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞中SOD積累與鎘含量大小有關(guān)，鎘含量大，植物體內(nèi)過(guò)氧化物積累增多，相應(yīng)SOD活性增強(qiáng)，緩解過(guò)氧化物積累對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生的損害（圖4）。

2.5 與鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)基因的表達(dá)

P型ATP酶（P type-ATPase）中HMA亞族能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種必需金屬以保證植物從土壤中吸取足夠的養(yǎng)分，然而這些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體在轉(zhuǎn)運(yùn)必需元素的同時(shí)，也大多可以參與鎘等有毒重金屬離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[28-30]；HVMT基因家族中HVMT-1，HVMT-3，HVMT-4等參與植物金屬硫蛋白的表達(dá)，而金屬硫蛋白能與有毒重金屬離子結(jié)合[31]。Real-time PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)龍葵中與鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)基因（P type-ATPase，HVMT-1，HVMT-3，HVMT-4）的表達(dá)。不同鎘含量土壤中龍葵的四種鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)具有相似性，鎘含量越高、基因表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)鎘的吸收也增多，尾礦>礦區(qū)>礦區(qū)邊緣>礦區(qū)周邊農(nóng)田>市內(nèi)>對(duì)照組（圖5）。

3 討論

過(guò)量的非必需重金屬鎘嚴(yán)重抑制植物生長(zhǎng)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[32-33]，通常鎘會(huì)降低植物對(duì)水分脅迫的耐性，在相對(duì)水分含量和葉片水勢(shì)較高時(shí)使膨壓?jiǎn)适?，影響植物?duì)水分吸收并引起根部的損傷[34]。鎘是光合作用的一種有效抑制劑，鎘進(jìn)入植物體內(nèi)，影響光合色素的合成，降低葉綠素含量，影響并破壞光合系統(tǒng)[35]。此外，植物吸收過(guò)量的鎘會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)氧化氫類(lèi)物質(zhì)，對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致酶活性喪失，生物膜破壞或生物氧化脅迫[36-37]。同樣的植物也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的緩解機(jī)制，例如產(chǎn)生超氧化物歧化酶等消除植物細(xì)胞中過(guò)多的過(guò)氧化物，上調(diào)或下調(diào)相關(guān)基因表達(dá)或是合成與重金屬結(jié)合的金屬硫蛋白和螯合蛋白等[38]。

在本試驗(yàn)中，土壤鎘含量越大，龍葵吸收的鎘也增多，而鎘也會(huì)對(duì)龍葵的生理生長(zhǎng)和光合特性產(chǎn)生較顯著影響，隨著鎘龍葵體內(nèi)鎘含量積累，過(guò)量的鎘可能減弱細(xì)胞分裂增長(zhǎng)從而影響龍葵的株高、根長(zhǎng)和生物量等生理指標(biāo)。龍葵葉片收到鎘脅迫，PSⅡ反應(yīng)系統(tǒng)中初始熒光水平顯著增大，最大原初光能轉(zhuǎn)化效率、最大電子傳遞速率顯著降低，這說(shuō)明PSⅡ反應(yīng)系統(tǒng)遭受破壞或可逆失活。同樣，植物捕光色素吸收光能后以熱的形式耗散過(guò)剩激發(fā)能的能力也顯著上升，它以這種形式來(lái)緩解鎘對(duì)植物體的損傷。試驗(yàn)中龍葵體內(nèi)鎘含量的積累還導(dǎo)致植物細(xì)胞的氧化脅迫，使植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧和 MDA，損傷植物DNA、膜脂蛋白等，加速細(xì)胞衰老和凋亡[4，39-40]。然而當(dāng)龍葵受到鎘脅迫時(shí)，立即合成各種抗氧化酶，如SOD、CAT、POD，這些酶能有效地將植物細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物還原成H2O，緩解過(guò)氧化物過(guò)多引起的損傷。比較8月份收獲的龍葵葉片中各鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)水平差異，與重金屬鎘轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因（P type-ATPase）及合成金屬硫蛋白有關(guān)基因（HVMT-1，HVMT-3，HVMT-4）都隨鎘的積累明顯上調(diào)，這與重金屬鎘的誘導(dǎo)有關(guān)，龍葵通過(guò)上調(diào)鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，更有效率地吸收土壤的養(yǎng)分及重金屬離子，導(dǎo)致龍葵體內(nèi)鎘的快速積累。另一方面，又通過(guò)上調(diào)合成金屬硫蛋白相關(guān)基因表達(dá)，快速合成金屬硫蛋白螯合重金屬鎘離子，緩解減弱鎘對(duì)龍葵的損傷。endprint

龍葵通過(guò)自身精細(xì)的調(diào)節(jié)，一邊有效吸收富集土壤中的鎘，一邊又快速合成相關(guān)蛋白消除或減弱鎘對(duì)自身的傷害，雖然植物抗鎘脅迫的機(jī)理已取得了階段性的進(jìn)展[41-42]，但是還有許多細(xì)節(jié)的調(diào)控不清晰，目前未發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)特異轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬鎘的蛋白的相關(guān)報(bào)道，龍葵對(duì)鎘吸收及抗逆性精細(xì)調(diào)控信號(hào)通路也不完善，這都是未來(lái)要努力的方向。本研究針對(duì)超富集植物龍葵在對(duì)鎘污染響應(yīng)及土壤的修復(fù)有良好的效應(yīng)，對(duì)植物修復(fù)土壤中有害重金屬有借鑒意義。

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