酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

楊欣欣，張彬，荀其寧，拓銳，胡國(guó)星，潘忠泉

（中國(guó)兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA，簡(jiǎn)稱(chēng)“酶免試驗(yàn)”）是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)的基本檢測(cè)技術(shù)，免疫臨床標(biāo)志物(抗原／抗體)具有無(wú)法替代的臨床意義，操作簡(jiǎn)便，技術(shù)可靠，因而酶免試驗(yàn)成為傳染病血清學(xué)標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物及內(nèi)分泌等各種臨床免疫指標(biāo)檢測(cè)的主導(dǎo)技術(shù)［1–3］。

酶標(biāo)分析儀是一種基于酶免試驗(yàn)的專(zhuān)用醫(yī)學(xué)儀器，因具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高、快速安全等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于醫(yī)院、血站、防疫站、生物制品生產(chǎn)企業(yè)等部門(mén)。JJG 861–2007［4］規(guī)定分別采用標(biāo)稱(chēng)波長(zhǎng)為405.0，450.0，492.0，620.0 nm的介質(zhì)膜干涉濾光片作為檢定酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)示值誤差及重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

當(dāng)白光入射到干涉濾光片內(nèi)部時(shí)，在多層介子膜上會(huì)產(chǎn)生多次反射。濾光片的光學(xué)玻璃基片及其表面所鍍的介子膜具有銳截止特性，使得透射光線變成了單色光［5–6］。目前國(guó)外暫無(wú)酶標(biāo)分析儀相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的報(bào)道。國(guó)內(nèi)在用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為吉林省計(jì)量科學(xué)研究院研制的酶標(biāo)分析儀檢定用濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（干涉濾光片），波長(zhǎng)范圍為400.0～700.0 nm，波長(zhǎng)不確定度為0.7 nm（k=2）。

筆者研制的酶標(biāo)分析儀檢定用波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）標(biāo)稱(chēng)峰值波長(zhǎng)分別為405.0，450.0，492.0，620.0 nm，峰值波長(zhǎng)不確定度為0.7 nm(k=2），該波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值穩(wěn)定、均勻性好，便于攜帶，有效期為1年，可滿足多通道酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)示值誤差及重復(fù)性檢定的需要。

1 主要儀器設(shè)備

外圓排鋸切割機(jī)：YTH1–A–JB型，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；

研磨機(jī)：HD2M9B–5L型，宜興晶科光學(xué)儀器有限公司；

拋光機(jī)：JY2M16B–5L型，益陽(yáng)精益機(jī)器制造有限公司；

真空鍍膜機(jī)：DM–450型，北京儀器廠；

紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)：Lambda900型，美國(guó)PE公司。

2 設(shè)計(jì)原理

光學(xué)玻璃具有穩(wěn)定的物理化學(xué)特性，受外界因素影響非常小。波長(zhǎng)標(biāo)定用窄帶濾光片的基本結(jié)構(gòu)是法布里–柏格濾光片，作為波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，要求濾光片滿足穩(wěn)定的中心波長(zhǎng)、窄的帶寬、高透過(guò)率、高的環(huán)境穩(wěn)定性、高的溫度穩(wěn)定性等性能要求，這些要求不是瞬時(shí)的而是永久的。

根據(jù)光學(xué)薄膜理論，選擇兩種不同折射率的材料組成多層光學(xué)薄膜元件來(lái)制備波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。其中，光學(xué)薄膜的峰值波長(zhǎng)、峰值透射比、半寬度根據(jù)式(1)～(3)確定：

式中：λ0——峰值波長(zhǎng)；

n——反射膜堆層數(shù)；

d——膜厚；

m——干涉級(jí)數(shù)；

Tmax——峰值透射比；

T12——反射膜的透過(guò)率；

A12——反射膜的吸收損耗；

2Δλ——半寬度。

由式(1)～(3)可知，調(diào)整反射膜的膜堆層數(shù)及膜厚可實(shí)現(xiàn)特定的峰值波長(zhǎng)；選擇高透過(guò)率的全介質(zhì)膜可以提高膜層的透射比，但會(huì)導(dǎo)致半寬度增大。為兼顧峰值透射比及半寬度，設(shè)計(jì)的膜系具體結(jié)構(gòu)為G(HL)3H(2L)(HL)3H，如圖1所示。

圖1 酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)膜系結(jié)構(gòu)示意圖

3 制備工藝

3.1 鍍膜材料的選擇

硫化鋅和冰晶石具有良好的光學(xué)性能，而且二者均有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，容易保持制作器件的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。硫化鋅折射率為2.35，透光范圍為400～13 000 nm，具有良好的應(yīng)力和良好的環(huán)境耐久性，堆積密度高，呈壓應(yīng)力；而冰晶石（Na3AlF6）折射率為1.35，透光區(qū)130～14 000 nm，堆積密度低，呈張應(yīng)力。硫化鋅和冰晶石兩者搭配起來(lái)鍍多層膜應(yīng)力很小，因此選擇硫化鋅和冰晶石作為波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的鍍膜材料。

作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基底材料，除了應(yīng)具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性之外，更重要的是其力學(xué)性質(zhì)。一方面基底與薄膜材料要有良好的結(jié)合力，確保薄膜不脫落不開(kāi)裂；另一方面需要基底的熱參數(shù)與薄膜膜系匹配?？晒┻x擇的基底材料有熔石英、微晶玻璃、K9玻璃等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，K9玻璃透過(guò)率好、硬度高、膜層附著力優(yōu)良，適合作為波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基底保護(hù)材料。

3.2 基片制備

經(jīng)光學(xué)冷加工即切割、粗磨、精磨、拋光等工藝加工基片材料，再經(jīng)鍍膜工藝將K9玻璃鍍?cè)诨妆砻妗?/p>

3.2.1 切割

用外圓排鋸切割機(jī)進(jìn)行光學(xué)切割，燒結(jié)金剛石鋸片基體為45#鋼，厚度為0.3 mm，金剛石粒度為210～255 μm；切割時(shí)控制線速度為20～40 m／s，在鋸片邊緣添加粒度為60～80 μm金剛砂及水，以防止鋸片過(guò)熱并提高切割效率，最終切割成30 mm×10 mm的光學(xué)玻璃基片。

3.2.2 研磨

以研磨機(jī)將玻璃基片研磨成精確厚度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基片，一般磨除量為0.2～1.0 mm。由于光學(xué)玻璃基片的凹陷深度隨磨料顆粒度的增大而增加，即研磨質(zhì)量隨粒度增大而變壞，因此開(kāi)始研磨時(shí)，要用粒度較大的磨料提高玻璃的磨除量，之后再用細(xì)磨料逐級(jí)研磨，使得玻璃表面的凹陷層和裂紋層的深度盡可能減小。根據(jù)拋光表面的質(zhì)量要求，最后一級(jí)研磨的玻璃凹陷層平均深度為3～4 μm，最大裂紋深度為10～15 μm。

將粘盤(pán)加熱，用石蠟或松香蠟將玻璃基片粘接于粘盤(pán)上，依次采用粒徑為40,25 μm的金剛砂作為磨料，在研磨機(jī)上進(jìn)行研磨，研磨機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)為70 r／min，直至光學(xué)玻璃表面的毛面變得非常細(xì)致。

3.2.3 拋光

經(jīng)過(guò)粗磨和精磨后的的玻璃基片表面有凹陷層，下面有裂紋層，經(jīng)研磨的玻璃基片是不透明的，必須拋去10～15μm的裂紋層，獲得符合理論要求的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基片。

拋光過(guò)程在拋光機(jī)上進(jìn)行，調(diào)節(jié)拋光機(jī)轉(zhuǎn)速為35～100 r／min，頂盤(pán)用毛氈粘于細(xì)鐵盤(pán)上，用石膏加水，將基片毛坯粘在底盤(pán)上。粘合前，須先檢查基片表面細(xì)磨程度，避免附有砂孔等缺陷而影響拋光質(zhì)量。粘合后先用粒徑25 μm的金剛砂細(xì)研磨，直到用放大鏡檢查符合要求后，用水沖洗，換用紅粉拋光。研磨時(shí)室內(nèi)溫度必須保持在20℃以上，玻璃表面的溫度保持在約25℃。

3.2.4 清洗

為了提高膜層的附著力和光學(xué)性能，采用定向離子清洗技術(shù)有效去除K9玻璃基底的二次污染、增加基底表面結(jié)合能，有效改善基片表面性質(zhì)。

3.3 鍍膜

鍍膜機(jī)的鐘罩上安裝有鹵素?zé)?，波長(zhǎng)涵蓋紫外到紅外波段，采用極值法進(jìn)行膜厚度監(jiān)控。光束射入鐘罩，通過(guò)基片從鐘罩射出，經(jīng)單色儀分光后被光電倍增管接收，光電流由放大器檢測(cè)，以監(jiān)控膜層厚度。單色儀用于控制波長(zhǎng)。硫化鋅和冰晶石分別放在兩個(gè)鉬片制成的加熱舟內(nèi)，鍍膜時(shí)以H層、L層交替加熱進(jìn)行蒸發(fā)。

為保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的性能，采取如下措施：

（1）采用大型修正擋板修正膜層的徑向均勻性，通過(guò)提高夾具的旋轉(zhuǎn)速度，修正角向均勻性，保證同一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同位置的中心波長(zhǎng)在規(guī)定的范圍之內(nèi)。

（2）由于膜層中包含大量的空隙，薄膜濾光片吸潮后膜層折射率升高，濾光片的中心波長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生明顯的漂移。采用離子束輔助蒸發(fā)的方法得到高堆積密度的薄膜，以減小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的波長(zhǎng)漂移。

（3）采用光學(xué)直接監(jiān)控法控制膜層厚度，前一層薄膜產(chǎn)生的厚度誤差可以被后一層薄膜的反向偏差所補(bǔ)償，提高標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的精度和穩(wěn)定性。

（4）采用膠合強(qiáng)度高、收縮率小、耐高低溫的光學(xué)環(huán)氧樹(shù)脂膠作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)膠合用的光學(xué)粘結(jié)劑，并在膜層上膠合K9平板玻璃，以防止膜層劃傷并提高膜層的穩(wěn)定性。

4 定值

按照J(rèn)JG 1034–2008中“7.3.3”條，儀器開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min，校正儀器波長(zhǎng)及透射比量值，對(duì)酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)檢定用濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行逐片定值［7］。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于儀器樣品室，以50 nm／min的掃描速度測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰值波長(zhǎng)，連續(xù)測(cè)量9次，取9次測(cè)量平均值作為標(biāo)準(zhǔn)值。

使用紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)對(duì)所制備的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在300～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)光譜曲線圖

由圖2可知，所研制的酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱(chēng)峰值波長(zhǎng)依次為405.0，450.0，492.0，620.0 nm，峰值透射比大于25%，半寬度小于15.0 nm，滿足規(guī)程要求。

5 不確定度分析

測(cè)量不確定度是表征被測(cè)量之值的分散性，并與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。測(cè)量不確定度由多個(gè)分量組成，其中一些分量可按統(tǒng)計(jì)分布來(lái)評(píng)定，以實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差表征［8］。酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰值波長(zhǎng)的測(cè)量不確定度主要由重復(fù)性、均勻性、穩(wěn)定性、定值儀器引入的不確定度確定。

5.1 重復(fù)性引入的不確定度u1

用定值裝置分別測(cè)試波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰值波長(zhǎng)，重復(fù)測(cè)量6次，計(jì)算6次測(cè)量結(jié)果算術(shù)平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，計(jì)算得u1=0.04 nm。

5.2 均勻性引入的不確定度u2

將測(cè)試儀器預(yù)熱、調(diào)節(jié)完畢，根據(jù)JJG 1006–1994及JJG 1034–2008 “7.3.3.3”，分別按照標(biāo)稱(chēng)波長(zhǎng)上下20 nm的掃描范圍及50.0 nm／min的掃描速率測(cè)試5套樣品不同位置（樣品的中心點(diǎn)、中心點(diǎn)上下各5 mm處共3點(diǎn)，以上3點(diǎn)左右2 mm處各1點(diǎn)）峰值波長(zhǎng)及峰值透射比值，并計(jì)算半寬度，每個(gè)取樣點(diǎn)連續(xù)檢測(cè)3次，對(duì)峰值波長(zhǎng)數(shù)據(jù)采用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理［9–10］，方差分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性考核結(jié)果

由表1可知，F(xiàn)

5.3 穩(wěn)定性引入的不確定度u3

在規(guī)定的貯存或使用條件下（12個(gè)月），按照先密后疏的原則，定期進(jìn)行特性量值的穩(wěn)定性檢驗(yàn)。根據(jù)直線擬合法評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算得斜率β1=-0.003 7，截距β0=491.1577，直線標(biāo)準(zhǔn)偏差s2=0.013 7，斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(β1)=0.026 0。

查表可知t0.95，4=2.78，則t0.95，4·s(β1)=0.072 3，顯然，t0.95，4·s(β1)>β1，表明直線斜率不顯著，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在考察期是穩(wěn)定的。

在穩(wěn)定性考察期12個(gè)月內(nèi)（X=12），標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引入的不確定度分量u3= s(β1)·X=0.32 nm。

為了保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，采用特制的包裝盒進(jìn)行包裝，非使用狀態(tài)應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于包裝盒內(nèi)，與包裝盒一同放入干燥器中，貯存于避光、陰涼、潔凈的環(huán)境中。

5.4 定值儀器引入的不確定度u4

定值儀器的波長(zhǎng)擴(kuò)展不確定度為0.07 nm(k=2)，由定值儀器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4=0.035 nm。

將以上不確定度分量合成，得：

擴(kuò)展不確定度U=kuc=0.66 nm≈0.7 nm （k=2）。

6 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)均勻性、穩(wěn)定性考核，酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻、穩(wěn)定，量值準(zhǔn)確，符合國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，能滿足酶標(biāo)分析儀波長(zhǎng)示值誤差及重復(fù)性的檢定／校準(zhǔn)需求。

［1］郭勇.醫(yī)學(xué)計(jì)量［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2002: 44.

［2］葉應(yīng)嫵，王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］. 2版.南京：東南大學(xué)出版社，1997: 208–209.

［3］倪星忠.臨床生化酶試劑方法［M］ .上海：華東師范大學(xué)出版社，1993: 127–128.

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