朱　鑫，易　潭，陳　琳，吳　萍，汪建華，陳　韜，張建社，褚武英

(1. 長沙學院生物與環(huán)境工程系，中國 長沙　410003；2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，中國 長沙　410128)

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翹嘴鱖miR-146a在胚胎發(fā)育過程中的表達及溫度對其表達的影響

朱鑫1, 2#，易潭1,2#，陳琳1，吳萍1，汪建華1，陳韜2，張建社1，褚武英1

(1. 長沙學院生物與環(huán)境工程系，中國 長沙410003；2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，中國 長沙410128)

摘要為了解翹嘴鱖胚胎發(fā)育中miR-146a的表達規(guī)律以及溫度對miR-146a表達的影響，將翹嘴鱖受精卵分別在22 ℃和25 ℃水溫下孵化，并利用實時熒光定量方法檢測miR-146a在各個發(fā)育階段的表達．結果顯示，在22 ℃孵化時，miR-146a的表達在原腸期前處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異(P>0.05)，在尾芽期后出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05)，并在出膜時達到最低值；在25 ℃孵化時，miR-146a的表達直到神經(jīng)胚期仍處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異(P>0.05)，發(fā)育進入尾芽期后表達顯著降低(P<0.05)，在肌效期達到最低值；miR-146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化同時期的表達都出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)．研究表明，miR-146a可能主要在胚胎發(fā)育后期起到調控胚胎發(fā)育的作用，在尾芽期后通過下調表達來促進胚胎的發(fā)育；并且溫度能影響miR-146a的表達，溫度升高會降低miR-146a在胚胎發(fā)育各個時期的表達，將有利于胚胎的發(fā)育．

關鍵詞翹嘴鱖；miR-146a；發(fā)育性表達；胚胎發(fā)育；溫度調節(jié)

ExpressionAnalysisofSiniperca ChuatsiMiR-146aDuringEmbryonic

上世紀80年代，隨著鱖魚人工繁殖獲得成功，我國開始大規(guī)模推廣鱖魚養(yǎng)殖，使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一．翹嘴鱖因其肉質細嫩而鮮美，無小刺，且富含蛋白質，現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場的緊俏商品和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要品種[1]．深入探索翹嘴鱖的發(fā)育機制能夠為魚類發(fā)育生物學研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一些有價值的參考資料．

microRNA(miRNA) 是真核生物中一類進化上保守的參與調控基因表達的非編碼小分子RNA．它通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補配對來促進靶mRNA降解或翻譯抑制，在基因表達中起著負調控作用[2-3]．miRNA在胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生和新成代謝等一系列生物過程中發(fā)揮重要的作用[4-5]，但是有關miRNA在胚胎的表達特性及其在魚類早期發(fā)育中的功能研究還很少．早期的研究表明miRNA對胚胎發(fā)育起到重要作用．鼠和人的胚胎干細胞在發(fā)育形成胚胎小體時，胚胎干細胞中一些特定的miRNA的表達會下調[6-7]，缺失miRNA的鼠和斑馬魚胚胎在原腸胚形成、神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成時出現(xiàn)發(fā)育畸形甚至停滯[8-9]．Kuang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠與Numb基因的3′端非翻譯區(qū)互補配對，并且驗證了miR-146a能夠抑制Numb的表達，而Numb調控的靶基因Notch參與一系列胚胎發(fā)育和形態(tài)形成過程，如成肌細胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和體節(jié)形成[11]，因此可以推斷miR-146a很可能參與調控胚胎的發(fā)育．

水溫可以改變胚胎發(fā)育所需時間，較高的孵化溫度能加速魚類胚胎的發(fā)育速率，縮短孵化所需的時間[12]．何利君[13]的研究顯示，翹嘴鱖胚胎發(fā)育在21，25和27 ℃下，分別經(jīng)過74.05，56.73和48.37h孵育后出膜．在適宜溫度范圍內，適當升溫可以加快胚胎發(fā)育的進程，但miRNA是否參與到水溫影響翹嘴鱖胚胎發(fā)育的分子機制中尚不明確．在本研究中，我們分別在22和25℃水溫下孵化翹嘴鱖的受精卵，并利用實時熒光定量的方法檢測miR-146a在幾個重要發(fā)育階段的表達，以此了解miR-146a在胚胎發(fā)育進程中的表達模式及水溫對miR-146a表達的影響．

1材料與方法

1.1實驗魚

實驗用親魚為湖南省水產(chǎn)科學研究所無病無傷、體格健壯、性腺成熟度好的翹嘴鱖，雌性個體為體質量1.0kg以上的2～4齡魚，雄性個體為體質量0.75kg以上的2～4齡魚．

1.2方法

1.2.1不同溫度下胚胎的孵化和取樣使用寧波市激素制品有限公司生產(chǎn)的絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體生成素釋放激素類似物和鯉鯽魚腦垂體(PG)對親魚進行人工催產(chǎn)，操作方法參考劉希良[14]等文獻報導．將受精卵置于直徑15cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放200～300顆，分別在22 ℃和25 ℃的水溫中孵化．期間，每半小時更換一次曝氣水以保證溶氧充足．自受精后定時將翹嘴鱖魚卵置于顯微鏡下觀察翹嘴鱖胚胎的發(fā)育進程，當所有魚卵半數(shù)以上達到某個時期時確定為到達該時期．當受精卵進入二細胞、囊胚、原腸、神經(jīng)、尾芽、肌效、心搏、出膜期時,分別取適量受精卵置于裝有Trizol的2mL離心管中，每個時期取5管平行樣，置于-20 ℃冰箱保存．

1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成保存于Trizol中的受精卵用破口槍頭吸打數(shù)次，直至胚胎全部破碎，然后置于裝有1mLTrizol的離心管中．總RNA提取流程參照TrizolReagent(Invitrogen)說明書操作．所有總RNA樣品分別取1μL作為模板，按照OneStepPrimeScriptmiRNAcDNAsynthesisKit試劑盒(寶生物公司，大連)的說明進行逆轉錄，合成的cDNA第一鏈，于4 ℃冰箱保存待用．

1.2.3實時熒光定量檢測miR-146a的表達根據(jù)Chu等[15]建立的鱖魚miRNA文庫，設計miR-146a特異性的上游引物，以管家基因β-actin作為胚胎發(fā)育階段樣品的內參基因[16]．用Primer5.0軟件設計熒光定量PCR的引物，引物由上海鉑尚生物公司合成 (見表1)．取2μL逆轉錄好的cDNA為模板，加入12.5μLSYBRPremixExTaqⅡ (寶生物公司, 大連)，1μL特異性的上游引物和1μL通用下游引物(Uni-miRqPCRPrimer, 10μmol/L, 寶生物公司)， 8.5μL的無菌水，總體積25μL，擴增反應在Bio-RadCFX96system(USA)上進行．擴增條件為：(1)95 ℃預變性60s；(2)擴增和定量，95 ℃變性5s，60 ℃退火和延伸25s，重復40個循環(huán)．(3) 繪制融解曲線(65～95 ℃，每0.1 ℃檢測一次熒光值)．

表1　熒光定量檢測用引物

注：miR-146a定量所使用的下游引物為通用引物，序列未公布，購自寶生物工程(大連)有限公司(濃度：10μmol/L)．

1.2.4數(shù)據(jù)處理相對表達結果計算公式為R=2-ΔΔCt，其中Ct值為PCR反應循環(huán)閾值，ΔΔCt的計算公式為：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組．采用SPSS12.0軟件對所得相對表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較(P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著)，結果以平均值±標準誤差(Mean±SE，n=5)表示．

2結果與分析

2.1miR-146a在胚胎發(fā)育性表達

有文獻報道m(xù)iRNA在不同的細胞和不同的發(fā)育階段有差異性的表達，并且它們參與細胞的生長、分化以及凋亡等過程[17-18]．目前miRNA在魚類胚胎發(fā)育階段的表達研究還較少，且暫未有文獻報道m(xù)iR-146a在魚類胚胎的發(fā)育性表達．圖1結果顯示，胚胎在22 ℃水溫孵化下，miR-146a的表達在發(fā)育早期處于較高水平，其中原腸期前的各時期表達沒有顯著性差異，進入尾芽期后顯著性地降低，并持續(xù)降低，在出膜期時達到最低水平．而在25 ℃孵化時，miR-146a的表達在神經(jīng)期前處于較高水平且各時期都沒有顯著性差異，在尾芽期顯著性地降低，在肌效期達到最低值，心搏期和出膜期處于較低水平并且之間沒有顯著性差異(圖1)．

圖1　miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同發(fā)育時期的相對表達情況．A和B分別為miR-146a在22 ℃和25 ℃水溫孵化下不同時期的發(fā)育性表達．相對表達值為平均值±標準誤差(n=5)．不同的字母代表存在顯著性差異(P<0.05)Fig.1　Detection of miR-146a expression at different embryonic developmental stages. A, B represent miR-146a expressed at different embryonic developmental stages when incubation under 22 ℃and 25 ℃ water temperature, respectively. Values are the mean ±SE, n=5. The different letters indicate significant differences between columns (P<0.05)

2.2miR-146a在不同溫度孵化下的差異性表達

圖1的結果顯示溫度影響了miRNA在胚胎發(fā)育中的表達．當比較胚胎發(fā)育同一時期在22 ℃和25 ℃水溫孵化下miR-146a的表達時發(fā)現(xiàn)，miR-146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化下同時期的表達都出現(xiàn)顯著性地降低，其中除出膜期外，其他時期的表達差異極顯著(P<0.01)(圖2)．

圖2　miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同水溫孵化下，同一時期的差異性表達．每個時期均以22 ℃孵化下的表達值作為對照，*代表顯著性差異(P<0.05)，**代表差異極顯著(P<0.01)Fig.2　The contrastive expression of miR-146a incubated under different water temperature. The data was expressed as the relative change compared with the expression level of each stage incubated under 22 ℃, asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05), double asterisk (**) indicates significance at P<0.01

3討論

miR-146a最初被發(fā)現(xiàn)在miRNA中參與天然免疫應答，當單核細胞受到細菌內毒素侵襲時，miR-146a的表達顯著上調[19]．近年來許多文獻報道，miR-146a調節(jié)的許多靶基因參與了細胞分化的作用，但這些研究主要集中在分析miR-146a對造血細胞的分化作用，而miR-146a對胚胎發(fā)育的作用暫未見到相關報道．Kuang等[10]的研究驗證了miR-146a能夠抑制Numb的表達．Numb是一種進化保守蛋白，其作為內源性細胞命運決定因子，對細胞分裂的命運起決定作用．Numb對胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育作用也已經(jīng)被證明[20-21]．Numb作為一個重要的細胞命運決定蛋白，參與Notch的負性調控，兩者的平衡決定了細胞分化的方向[22]．Notch信號轉導通路作為生物發(fā)育分化中高度保守的通路，通過與配體的相互作用產(chǎn)生級聯(lián)瀑布效應，參與細胞發(fā)育過程中分化方向的選擇，并對細胞的增殖及凋亡也起著重要的作用[23-24]．Notch信號通路在胚胎發(fā)育中起到調節(jié)細胞增殖和決定細胞命運的作用[25]．激活Notch信號能夠促進肌原細胞的增殖，并降低MyoD和myogenin的表達來延遲成肌細胞的分化[26]．miR-146a及其靶基因的研究為進一步了解miR-146a在胚胎發(fā)育中潛在的作用提供了一些重要的理論依據(jù)．

翹嘴鱖miR-146a胚胎發(fā)育性表達結果顯示，在22 ℃和25 ℃水溫孵化下，miR-146a表達規(guī)律趨勢總體相似，但在不同溫度下，miR-146a的表達在幾個時期經(jīng)歷了微調，說明溫度確實影響了miR-146a的表達．本文結果顯示在胚胎發(fā)育早期(二細胞到神經(jīng)胚期)miR-146a的表達趨于穩(wěn)定且處于較高水平(除22 ℃神經(jīng)胚期有顯著性上升)，在進入尾芽期后表達都顯著性地降低．Giraldez等[27]的研究表明miRNA的作用并不是在發(fā)育早期決定細胞的命運而是影響發(fā)育后期組織的發(fā)育和形成，而在神經(jīng)胚期前胚胎的大部分組織器官還未開始分化，本文結果與Giraldez等的結論相符．胚胎發(fā)育經(jīng)過神經(jīng)胚期后，是器官形成的主要階段，而本文結果顯示miR-146a的表達在尾芽期顯著降低，表明miR-146a的靶基因在這個階段后受到其抑制作用將明顯降低，并推測miR-146a的靶基因的作用可能是促進胚胎發(fā)育的．Kuang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Numb是miR-146a的靶基因，Numb能夠促進胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育[20-21]，Numb參與調節(jié)的Notch信號通路也對胚胎的發(fā)育起到重要的作用．

溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的一個主要的外在因子．大量研究表明，在適宜溫度下，隨著水溫的升高，胚胎的發(fā)育進程加快，孵化所需時間縮短[28-29]，但是miRNA的表達是否受到溫度的影響還未見相關報道．從圖2可以看出，在25 ℃孵化時，miR-146a在不同階段的表達都比22 ℃時出現(xiàn)顯著性降低．這一結果表明溫度升高能降低miR-146a的表達，從而調節(jié)胚胎的發(fā)育．有研究表明肌纖維增生和增粗的速率在較高的水溫孵化時都會升高，但是溫度對肌纖維的增粗效果強于增生[5]．在25 ℃孵化時，miR-146a的表達顯著性降低能增強Numb對Notch信號通路的抑制作用，促進成肌細胞的分化，從而有利于胚胎中肌肉組織形成．這一結果表明了miR-146a在參與水溫調節(jié)胚胎發(fā)育的過程中是通過下調來促進發(fā)育的．

4結論

研究表明，miR-146a在胚胎發(fā)育早期(神經(jīng)期前)的作用不明顯．在胚胎發(fā)育后期(尾芽期至出膜)，miR-146a通過下調其表達來促進胚胎的發(fā)育．而水溫升高能顯著降低miR-146a在胚胎發(fā)育每個時期的表達，減少其對靶基因Numb的抑制，發(fā)揮促進細胞分化的作用，從而有利于胚胎發(fā)育的進程．

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(編輯王健)

DevelopmentandEffectofTemperatureonMiR-146aExpression

ZHU Xin1,2#, YI Tan1,2#, CHEN Lin1,WUPing1,WANGJian-hua1,

CHEN Tao2,ZHANGJian-she1, CHU Wu-ying1*

(1.DepartmentofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ChangshaUniversity,Changsha410003,China;

2.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha410128,China)

AbstractTo investigate the expression pattern of miR-146a in embryonic developmental stage and the effect of temperature on the expression of miR-146a in Siniperca chuatsi, the embryos were incubated under different temperatures and the expression of miR-146a during embryonic developmental stage was detected by RT-qPCR. The results showed that the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference before gastrula stage when the embryos incubated under 22 ℃ (P>0.05). And then the expressions of miR-146a decreased after tail-bud stage and decreased to the lowest level at larval stage (P<0.05). When the embryos incubated under 25 ℃, the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference till neurula stage (P>0.05). Once at tail-bud stage, the expression of miR-146a significantly decreased (P<0.05) and to the lowest level at muscular effect stage. It was interesting that the expressions of miR-146a were significantly decreased at each developmental stage incubated under 25 ℃ when compared with 22 ℃ incubation (P<0.05). The results indicated that miR-146a mainly involved in regulating embryonic development during later embryonic developmental stages and promoted embryonic development by down regulation its expression. In addition, the expressions of miR-146a could decrease when the incubation temperature increased, and miR-146a might involve in the effect of temperature on embryonic development of Siniperca chuatsi.

Key wordsSiniperca chuatsi; miR-146a; developmental expression; embryonic development; temperature regulation

中圖分類號Q752; S917.4

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2015)05-0021-06

通訊作者*,E-mail：chuwuying18@sina.com

基金項目：#本文同等貢獻作者.

收稿日期：2014-12-15

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.05.004