堿木素焦油的抑菌活性及機(jī)理

初雷霞，江金茂，趙永坡，許文耀，江茂生

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002;2.福建南紙股份有限公司，福建南平353000;3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

從天然產(chǎn)物尤其是植物中開發(fā)高效、低毒、環(huán)境兼容性好的天然產(chǎn)物殺菌劑是近幾年農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)[1]，已得到的有抑菌作用的活性物質(zhì)如萜類化合物、皂苷類、酚類、生物堿及多肽類物質(zhì)等[2].但有關(guān)天然產(chǎn)物殺菌機(jī)理的報(bào)道較少[3].

課題組前期對(duì)竹材進(jìn)行熱解獲得高得率的竹焦油，并且發(fā)現(xiàn)竹焦油對(duì)植物病原菌物和病原細(xì)菌皆有很好的抑制活性[4].鑒于堿木素是造紙工業(yè)的主要副產(chǎn)物，其中僅含少量纖維素和半纖維素，價(jià)廉且來(lái)源極為廣泛，本文以堿木素為原料，熱解制備出液化產(chǎn)物堿木素焦油，研究其對(duì)植物病原菌物的抑制效果和抑制敏感菌的作用機(jī)理，為將堿木素焦油工業(yè)化開發(fā)為一種新型天然產(chǎn)物殺菌劑奠定基礎(chǔ)，也為天然產(chǎn)物殺菌劑的作用機(jī)理研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

將制漿廢液中的堿木素酸沉、烘干后，參照江茂生等[4]的方法，用自制固定床熱解設(shè)備進(jìn)行熱解，將收集的餾出液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得堿木素焦油，再用丙酮溶解配制成10%的母液，低溫貯藏備用.

1.2 供試病原菌物

16種供試植物病原菌物如表1，由福建農(nóng)林大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供.

表1 供試病原菌物及其受抑制率Table 1 The tested phytopathogenic fungi and its inhibitory ratios

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 堿木素焦油對(duì)供試菌抑制作用的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)抑制法進(jìn)行測(cè)定.配制含1000 μg·mL－1堿木素焦油的PSA平板，以含等量溶劑的PSA作對(duì)照;在培養(yǎng)基上接種直徑0.5 cm的供試菌菌餅，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每個(gè)處理3次重復(fù).待對(duì)照菌絲生長(zhǎng)至平板直徑2/3時(shí)，測(cè)量各處理的菌絲生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率.

1.3.2 堿木素焦油對(duì)P.capsici抑制作用的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[5]，將堿木素焦油與甲霜靈分別配制成5個(gè)系列濃度的帶毒培養(yǎng)基，分別接種直徑0.5 cm的菌餅，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù).待對(duì)照菌絲生長(zhǎng)至平板直徑的2/3時(shí)，測(cè)量各處理菌絲生長(zhǎng)直徑，計(jì)算抑制率.

參照文獻(xiàn)[6]，將堿木素焦油與甲霜靈分別配制成5個(gè)系列濃度;制備濃度為1×105個(gè)·mL－1P.capsici孢子囊懸浮液;分別取各濃度的藥劑與孢子囊懸浮液各1 mL混勻，吸取一滴置于凹玻片中央，28℃保濕培養(yǎng)，6 h后檢查孢子囊的萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率.

將抑制率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，采用SPSS 19.0軟件計(jì)算出抑制機(jī)率值與藥劑濃度對(duì)數(shù)的毒力回歸方程，求出EC50、EC90及其95%置信區(qū)間.計(jì)算置信區(qū)間時(shí)，采用黃昌華[7]的建議，將對(duì)照平均菌落直徑毫米數(shù)作為供試生物個(gè)體數(shù)(n).

1.3.3 堿木素焦油對(duì)P.capsici有氧呼吸抑制作用的測(cè)定 采用改裝的Wasburg微量氣體呼吸儀測(cè)定不同濃度堿木素焦油處理下P.capsici的氧呼吸速率.將供試菌活化后，取直徑為0.5 cm的菌餅置于含藥的PS培養(yǎng)基中，利用NaOH吸收P.capsici呼出的CO2，通過(guò)數(shù)顯微壓差儀測(cè)定P.capsici在28℃恒溫條件下的氧呼吸量.每5 min記錄1次因呼吸代謝消耗氧氣導(dǎo)致的壓力減少值，連續(xù)記錄120 min.以不加藥同條件下P.capsici的氧呼吸量為對(duì)照.

1.3.4 堿木素焦油對(duì)P.capsici細(xì)胞膜作用的測(cè)定 采用電導(dǎo)率法測(cè)定堿木素焦油對(duì)P.capsici胞內(nèi)電解質(zhì)滲出量的影響.采用PS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)P.capsici至對(duì)數(shù)期，收集菌絲.分別取1 g菌絲，加入到30 mL不同濃度(0、62.5、125、250、500、1000 μg·mL－1)的藥劑中并使菌絲分散懸浮，立即測(cè)定菌絲懸浮液的電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化情況.

取上述不同濃度堿木素焦油處理P.capsici 24 h后的菌懸液，過(guò)濾，采用考馬斯亮藍(lán)法[8]測(cè)定濾液中的蛋白質(zhì)含量，采用DNS法[8]測(cè)定濾液中的還原糖含量，分析堿木素焦油對(duì)P.capsici胞內(nèi)蛋白質(zhì)和還原糖滲出量的影響.

1.3.5 堿木素焦油對(duì)P.capsici胞外纖維素酶及多聚半乳糖醛酸酶活性抑制作用的測(cè)定 參照孫文秀[9]的方法稍作改動(dòng)進(jìn)行測(cè)定.將 P.capsici接種到 Czapek-Dox 液體培養(yǎng)基(KNO32.0 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，維生素 B10.2 g，L-天冬酰胺 0.5 g，果膠 10 g，蒸餾水 1000 mL)中靜置(28℃)培養(yǎng)7 d后抽濾得到濾液，離心(6000 r·min－1×30 min)，取上清液，即為粗酶液.

分別取1 mL酶液，加入計(jì)量堿木素焦油與酶作用5 min;加入2.5 mL緩沖液，45℃水浴下預(yù)熱10 min;加1 mL 1%CMC-Na，酶解反應(yīng)120 min;立即加入1.5 mL DNS，100℃煮沸5 min，流水冷卻，補(bǔ)加水定容至20 mL;以加同劑量藥且不含底物的處理溶液作為參比液，540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度藥劑處理的酶反應(yīng)體系的光密度.將酶反應(yīng)底物換成1%果膠，其他操作步驟相同.根據(jù)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出酶反應(yīng)降解CMC-Na、果膠產(chǎn)生的還原糖量.以45℃、pH=5.0的條件下分解多糖1 h每產(chǎn)生1 mg單糖為一個(gè)酶活單位[9]，計(jì)算堿木素焦油作用后的纖維素酶和多聚半乳糖醛酸酶活性.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿木素焦油對(duì)供試菌的抑制作用

由表1可以看出，堿木素焦油濃度在1000 μg·mL－1時(shí)，對(duì)16種病原菌物均有一定的抑制作用，抑制率為43.75% －100%.其中，對(duì)15種病原菌物的抑制率在60%以上，對(duì) P.capsici、B.paeoniae、C.higginsianum、R.solani、S.rolfsii的抑制率可達(dá) 100%;對(duì) G.candidum 的抑制率最低，為 43.75%.可見，堿木素焦油對(duì)植物病原菌物的抑制作用具有一定的廣譜性.

通過(guò)多重比較發(fā)現(xiàn)，堿木素焦油對(duì)不同屬的菌株 P.capsici、B.paeoniae、C.higginsianum、R.solani、S.rolfsii的抑制作用差異不顯著(P＞0.05);對(duì)同一屬中，如Botrytis屬中的2個(gè)菌株，Colletotrichum屬中的C.glosoporioides、C.theae-sinensis和 C.higginsianum 3 個(gè)菌株，抑制作用的差異也不顯著(P ＞0.05).由此可知，堿木素焦油對(duì)植物病原菌物的抑制作用沒(méi)有明顯的屬特異性.但由于樣本數(shù)量有限，要得出其作用規(guī)律還需進(jìn)一步研究.

2.2 堿木素焦油對(duì)P.capsici的毒力

甲霜靈是防治由P.capsici引起的植物疫病的傳統(tǒng)藥劑.測(cè)定結(jié)果表明，堿木素焦油和甲霜靈對(duì)P.capsici菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程分別為 y=1.65x+1.58(R2=0.9920)和 y=1.56x+0.97(R2=0.9805);對(duì)孢子萌發(fā)的毒力回歸方程分別為 y=1.80x+0.65(R2=0.9317)和 y=3.07x －4.52(R2=0.9256).由表 2可見，堿木素焦油對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50及EC90均低于甲霜靈，菌絲對(duì)堿木素焦油的敏感性比孢子更強(qiáng).

表2 堿木素焦油對(duì)P.capsici菌絲及孢子萌發(fā)的毒力Table 2 Virulence of alkali lignin tar on mycelium growth and spore germination of P.capsici

2.3 堿木素焦油對(duì)P.capsici有氧呼吸的抑制作用

測(cè)定結(jié)果(圖1)表明，當(dāng)用藥濃度為250 μg·mL－1時(shí)，與對(duì)照相比，P.capsici的有氧呼吸明顯受到抑制，且隨藥劑處理時(shí)間的延長(zhǎng)作用增強(qiáng);當(dāng)用藥濃度達(dá)到1000 μg·mL－1時(shí)，P.capsici的有氧呼吸活動(dòng)微弱，處理時(shí)間達(dá)120 min時(shí)，氧氣的消耗量仍很少，表明P.capsici的有氧呼吸幾乎完全被抑制.

2.4 堿木素焦油對(duì)P.capsici細(xì)胞膜的作用

在菌絲量一定的情況下，菌絲懸浮液的電導(dǎo)率變化能夠體現(xiàn)菌絲細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的滲透情況，從而間接反映菌絲細(xì)胞膜的透性變化.由圖2可見，對(duì)照組的電導(dǎo)率緩慢上升，約30 min后達(dá)到平穩(wěn);500和1000 μg·mL－1堿木素焦油均會(huì)快速提高P.capsici菌絲懸浮液的電導(dǎo)率;1000 μg·mL－1劑量下，菌懸液的電導(dǎo)率在前5 min內(nèi)迅速上升，約10 min后達(dá)到平穩(wěn).

圖1 堿木素焦油對(duì)P.capsici有氧呼吸的影響Fig.1 Effects of alkali lignin tar on respiration of P.capsici

圖2 堿木素焦油對(duì)P.capsici電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of alkali lignin tar on cells conductivity of P.capsici

由圖3－4可以看出，隨藥劑處理濃度的升高，P.capsici的蛋白質(zhì)及還原糖的滲透量均出現(xiàn)上升趨勢(shì);在處理濃度達(dá)到 500 μg·mL－1時(shí)，P.capsici的蛋白質(zhì)滲透量顯著提高;當(dāng)濃度超過(guò) 250 μg·mL－1時(shí)，P.capsici的還原糖滲透量顯著提高.

細(xì)胞膜是一種選擇透過(guò)性膜，能夠保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，正常生長(zhǎng)情況下，細(xì)胞膜內(nèi)外的物質(zhì)交換處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài).P.capsici蛋白質(zhì)及還原糖的滲出趨勢(shì)與電解質(zhì)外滲變化結(jié)果，共同反映出堿木素焦油能夠作用于P.capsici的細(xì)胞膜，使P.capsici的細(xì)胞膜受損，通透性變大，從而使其胞內(nèi)蛋白質(zhì)及還原糖、電解質(zhì)等物質(zhì)透出，造成菌絲生長(zhǎng)緩慢乃至凋亡.

圖3 堿木素焦油對(duì)P.capsici胞內(nèi)蛋白滲出量的影響Fig.3 Effects of alkali lignin tar on proteins penetration from cells of P.capsici

圖4 堿木素焦油對(duì)P.capsici胞內(nèi)還原糖滲出量的影響Fig.4 Effects of alkali lignin tar on reducing sugar penetration from cells of P.capsici

2.5 堿木素焦油對(duì)P.capsici纖維素酶及多聚半乳糖醛酸酶活性的抑制作用

生物質(zhì)熱解焦油中一般含有大量的由木質(zhì)素分解產(chǎn)生的酚類物質(zhì)[4]，具有很強(qiáng)的使蛋白質(zhì)和酶變性的性能.由圖5－6可以看出，隨藥劑處理濃度的升高，P.capsici纖維素酶及多聚半乳糖醛酸酶的活性呈現(xiàn)類似的遞降趨勢(shì).在125 μg·mL－1濃度處理下，堿木素焦油對(duì)這2種酶的活性有輕微抑制作用;當(dāng)濃度高于500 μg·mL－1時(shí)，會(huì)顯著抑制這2種酶的活性，抑制率均達(dá)到40%以上，并且隨藥劑濃度升高抑制作用繼續(xù)增強(qiáng).纖維素酶及多聚半乳糖醛酸酶是P.capsici侵染寄主時(shí)釋放的主要酶[10]，其活性受到抑制，可以推測(cè)堿木素焦油能夠降低P.capsici侵染寄主的能力.

圖5 堿木素焦油對(duì)P.capsici纖維素酶活性的影響Fig.5 Effects of alkali lignin tar on cellulase enzyme activity of P.capsici

圖6 堿木素焦油對(duì)P.capsici多聚半乳糖醛酸酶活性的影響Fig.6 Effects of alkali lignin tar on polygalacturonase enzyme activity of P.capsici

3 結(jié)論

本研究表明，堿木素焦油具有比較廣譜的抑菌作用，對(duì)供試的10個(gè)屬中的16種植物病原菌物均有不同程度的抑制作用.堿木素焦油對(duì)P.capsici菌絲及孢子萌發(fā)的EC50及EC90均低于甲霜靈.

堿木素焦油對(duì)P.capsici有復(fù)合的抑菌作用靶位點(diǎn).它能夠通過(guò)抑制P.capsici的有氧呼吸代謝途徑導(dǎo)致其能量供應(yīng)受到限制，使細(xì)胞內(nèi)的各種需能代謝反應(yīng)無(wú)法完成;同時(shí)，能夠破壞P.capsici的細(xì)胞膜，使其通透性變大，損失胞內(nèi)蛋白質(zhì)、還原糖、電解質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂;此外，能夠使纖維素酶及多聚半乳糖醛酸酶活性降低而抑制菌絲生長(zhǎng).因此，以造紙工業(yè)的副產(chǎn)物堿木素為原料，熱解制備堿木素焦油并開發(fā)為農(nóng)用殺菌劑，對(duì)于降低造紙工業(yè)污染及促進(jìn)堿木素的高值化利用具有重要意義.

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