中藥復方“益腎固沖湯”對人乳腺癌細胞株MCF-7增殖及凋亡的影響

白羽臧學麗1張超2崔桂花李文亮薛瑩雪肖蕭徐廣宇3閆魏魏4

(吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林吉林132001)

摘要〔〕目的探討益腎固沖湯抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡的作用和抗癌分子的機制。方法體外培養(yǎng)人乳腺細胞株(MCF)-7細胞利用MTT法觀察益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用，用流式細胞儀檢測益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7凋亡及細胞周期的影響。結(jié)果益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖具有抑制作用，都具有明顯的時-效和量-效關(guān)系。人乳腺癌細胞MCF-7細胞經(jīng)過不同濃度的益腎固沖湯處理24、48、72 h后，各組均呈現(xiàn)不同程度的凋亡，且凋亡率隨著計量的增加、時間的延長而逐漸增加。益腎固沖湯在40 μg/ml量、作用72 h時具有統(tǒng)計學差異，細胞凋亡率最高，達17.93%，與正常對照組相比，G0/G1期細胞比率隨作用時間延長在逐漸減少，G2/M期的細胞比率隨作用時間延長在逐漸增加，細胞生長周期較明顯停滯在G2/M期，具有明顯時間依賴性。結(jié)論益腎固沖湯可以抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖，誘導細胞凋亡，具有明顯的量效和時效關(guān)系。細胞的增殖抑制與誘導凋亡作用與G2/M期有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕益腎固沖湯；乳腺癌；人乳腺癌細胞株；抑制增殖；細胞凋亡

中圖分類號〔〕R73〔

基金項目：吳階平基金(No.320.6750.13229)，吳階平基金(No.320.6750.13216)，吉林教育廳“十二五”科學技術(shù)研究課題(No.〔2014〕505)

通訊作者：閆魏魏 (1989-)，男，碩士，主要從事急慢性腹痛的診斷與治療研究。

1長春高等醫(yī)學?？?吉林大學基礎醫(yī)學院

3北華大學藥學院4吉林大學第一附屬醫(yī)院

第一作者：白羽(1980-)，女，講師，博士，主要從事中藥成分分析研究。

目前臨床常用的治療乳腺癌主要有內(nèi)分泌治療、放射治療、化療、誘導分化治療等。但是，幾乎都存在作用靶點單一，療效不盡人意，毒副作用大等缺點。我國傳統(tǒng)的中藥復方，有望成為突破這些瓶頸輔助的利器。本實驗選用中藥復方“益腎固沖湯”對激素依賴性腫瘤乳腺癌激素受體的人乳腺癌細胞株(MCF-7)雌激素受體(ER+)進行研究。通過研究復方在生理劑量環(huán)境及藥理劑量環(huán)境下對MCF-7細胞增殖及凋亡的影響，為中藥在乳腺癌的輔助治療中的安全性和有效性提供實驗室依據(jù)及理論基礎。

1材料與方法

1.1實驗藥物MCF-7由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，完全培養(yǎng)基為90%RPMI-1640+10%胎牛血清(FBS)，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。益腎固沖湯，購買于吉林大藥房。青霉素、鏈霉素混合液，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，RPMI-1640(美國GIBCO)，二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Amresco)，膜聯(lián)蛋白V熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2主要試劑與耗材超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱，臺式低速離心機，酶標儀，生物倒置熒光顯微鏡，流式細胞儀(美國FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.3方法

1.3.1(MTT)法觀察益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖抑制作用取對數(shù)生長期MCF-7細胞，經(jīng)消化、計數(shù)、配制成濃度為5×104個/ml的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細胞培養(yǎng)懸液(每孔5×103個細胞)，將細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖液清洗2次，用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入200 μl相應含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組，陽性對照組(加入不同濃度的益腎固沖湯2×10-1、2×10-2、2×10-3、2×10-4、2×10-5g/ml)。96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h。將96孔板進行MTT染色，λ=490 nm，測定OD值。計數(shù)各組別抑制率及藥物IC50。實驗組抑制率(%)=(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/陰性對照組OD值×100%。應用SPSS17.0通過機率單位加權(quán)回歸法計算IC50。

1.3.2流式細胞儀檢測益腎固腎湯對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響隨機分為空白對照組(不加藥物組)、益腎固沖湯用藥組(每孔加入低濃度2.5 μg/ml、中濃度10 μg/ml和高濃度40 μg/ml，用0.2%DMSO溶解)。孵育時間為24、48、72 h。之后對細胞進行細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代。流式細胞儀(Annexin V/PI雙染色法)檢測益腎固沖湯對MCF-7細胞凋亡的影響。

1.3.3流式細胞儀檢測益腎固沖湯對MCF-7細胞凋亡周期的影響隨機分為陰性對照組(不加藥物組)、益腎固沖湯用藥組(每孔加入低濃度2.5 μg/ml、中濃度10 μg/ml和高濃度40 μg/ml，用0.2%DMSO溶解)。孵育時間為24、48、72 h。對細胞進行細胞復蘇、培養(yǎng)、傳代。將對數(shù)生長期的MCF-7細胞消化接種到六孔板中，次日，待細胞貼壁后，根據(jù)組別設置加入相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組。作用24、48、72 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細胞。用磷酸緩沖液洗滌細胞一次(離心2 000 r/min，5 min)收集5×105細胞。制備的單細胞懸液用體積分數(shù)為70%乙醇固定2 h，4℃保存，染色前用磷酸緩沖液洗去固定液(細胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾一次)。加100 μl RNaseA37℃水浴30 min。再加入400 μl碘化丙啶(PI)染色混勻，4℃避光30 min。上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

2結(jié)果

2.1益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響隨益腎固沖湯濃度的增高及用藥時間的延長，對乳腺癌MCF-7細胞的增殖抑制的作用逐漸增強。與陰性對照組相比，除劑量為2×10-5g/ml，作用時間24 h組無統(tǒng)計學意義外，其余各組均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？梢娨婺I固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖起到抑制作用，且具有明顯的量效與時效關(guān)系。見表1。

組別(μg/ml)24hOD值(x±s)抑制率(%)48hOD值(x±s)抑制率(%)72hOD值(x±s)抑制率(%)對照組0.322±0.23122.350.362±0.0091)45.30.242±0.00673.42×10-5g/ml0.342±0.0163.850.591±0.0081)7.160.734±0.0111)20.682×10-4g/ml0.354±0.0071)9.750.576±0.0111)15.350.724±0.0121)33.282×10-3g/ml0.341±0.0101)13.790.563±0.0081)22.440.513±0.0071)41.342×10-2g/ml0.347±0.0091)16.130.492±0.0051)27.910.389±0.0051)54.622×10-1g/ml0.336±0.0041)18.690.459±0.0061)31.590.321±0.0101)66.21

與對照組比較：1)P<0.05

2.2益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響人乳腺癌MCF-7細胞經(jīng)過不同濃度的益腎固沖湯處理24、24、72 h后，各組均呈現(xiàn)不同程度的凋亡，尤其中晚期細胞的凋亡趨勢明顯，總凋亡率隨著劑量的增加、時間的延長而逐漸增高。在益腎固沖湯40 μg/ml、作用72 h后，誘導細胞凋亡能力最強，總凋亡率為73.5%。見圖1。

圖1　不同劑量益腎固沖湯作用24、48、72 h人乳腺癌 MCF-7細胞的總凋亡率

2.3益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖周期的影響見表2。低、中、高濃度益腎固沖湯作用于人乳腺癌MCF-7細胞

表2益腎固沖湯對人乳腺癌MCF-7細胞增殖周期的影響(%)

時間組別G1SG2凋亡率24h陰性對照組54.626.7518.650秋水仙素2.5μg/ml54.1228.8916.990秋水仙素10μg/ml51.2327.8620.911.54秋水仙素40μg/ml47.8826.7925.333.9248h陰性對照組51.3530.3218.330秋水仙素2.5μg/ml46.3829.7823.845.11秋水仙素10μg/ml44.6928.4526.867.32秋水仙素40μg/ml43.5227.1629.327.0472h陰性對照組54.5927.9117.50秋水仙素2.5μg/ml44.6527.1328.225.35秋水仙素10μg/ml42.3925.9731.646.24秋水仙素40μg/ml34.6427.6137.7517.93

24、48、72 h后，以陰性對照組相比，G0/G1期細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸減少；S期細胞比例基本不變；G2/M期的細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸增多，細胞生長周期較明顯的停滯在G2/M期，細胞G2/M期堆積，具有明顯時間依賴性，益腎固沖湯40 μg/ml，作用72 h時，MCF-7細胞凋亡率最高，達17.93%。

3討論

乳腺癌是一個世界范圍內(nèi)嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，其中老年乳腺癌的特點為臨床分期晚、病理分級高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多〔1〕。然而目前的乳腺癌治療方案幾乎都存在作用靶點單一，療效不盡人意，毒副作用大等缺點，這些成為臨床腫瘤治療的瓶頸。我國傳統(tǒng)的中藥復方，有望成為突破這些瓶頸輔助的利器。采用中藥復方對老年乳腺癌進行聯(lián)合治療，已被臨床證明行之有效〔2，3〕。其機制在于中醫(yī)強調(diào)從整體出發(fā)，調(diào)整機體陰陽、氣血、臟腑功能的平衡，內(nèi)治和外治相結(jié)合，根據(jù)不同的臨床證候，采用辨證論治。事實表明，中醫(yī)藥能促進老年乳腺癌患者術(shù)后體質(zhì)的恢復；減輕乳腺癌放化療等輔助治療所致的毒副反應；不同程度地緩解晚期乳腺癌患者的臨床癥狀。這對改善患者的生存質(zhì)量，提高生存率，降低復發(fā)率，都具有重要的臨床意義和廣泛的應用前景。

中醫(yī)認為乳腺癌的主要病因和發(fā)病機制在于：肝氣郁結(jié)、沖任失調(diào)、毒熱蘊結(jié)、氣血兩虛。肝氣郁結(jié)，肝經(jīng)失于疏泄，氣血奎滯，乳絡不暢，則乳房結(jié)塊；先天不足，或多產(chǎn)房勞，肝腎虧虛，沖任失養(yǎng)，致乳絡不榮，則乳房腫塊質(zhì)硬；氣火痰熱，結(jié)聚肝胃二經(jīng)，經(jīng)脈疲滯，化生乳巖，毒熱蘊結(jié)，致腫塊破潰，則浸淫穢臭；乳巖日久，氣血耗傷，則貧血消瘦，疼痛難忍，五臟俱衰。根據(jù)乳腺癌的臨床演變及特點，中醫(yī)專家認為其治療上應以清熱滋陰，補益肝腎為主。益腎固沖湯是依據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論組建的中藥復方，由菟絲子、覆盆子、杜仲、川斷、桑寄生、熟地、白芍、阿膠、黨參、陳皮、甘草等11味中藥組成。此方在臨床進行了基于病癥的療效觀察，表明其能夠明顯增加乳腺癌病人的5年存活率。

本實驗顯示益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖具有抑制作用，都具有明顯的時-效和量-效關(guān)系。通過益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖影響的研究，發(fā)現(xiàn)益腎固沖湯對MCF-7有明顯的抑制作用，為中藥治療乳腺癌奠定了理論依據(jù)。

中藥能通過多種方式干擾腫瘤的生長、代謝、增殖等過程。通過流式細胞儀儀檢測益腎固沖湯對MCF-7細胞的凋亡作用。結(jié)果顯示益腎固沖湯能阻滯細胞周期，對DNA合成有抑制作用，對誘導細胞凋亡具有明顯的量效、時效關(guān)系。且MCF-7細胞中晚期凋亡趨勢明顯。因此益腎固沖湯具有較好的抗腫瘤活性。

在益腎固沖湯對MCF-7細胞增殖周期的影響的實驗中與陰性對照組相比，G0/G1期細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸減少；S期細胞比例基本不變；G2/M期的細胞比率隨作用時間延長、濃度的增加在逐漸增多，細胞生長周期較明顯的停滯在G2/M期，細胞G2/M期堆積，具有明顯時間依賴性。

綜上所述，益腎固沖湯可以抑制MCF-7細胞的增殖，誘導細胞凋亡，具有明顯的量效和時效關(guān)系，細胞的增殖抑制與誘導凋亡作用與G2/M期有關(guān)。

4參考文獻

1隗立兵，康驊，海濤，等.老年乳腺癌 140 例的臨床特點和治療〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(15)：2858-60.

2孫燕.臨床腫瘤內(nèi)科手冊〔M〕.第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：586-97.

3鄒慶華，姜玉石，李凱.胸苷磷酸化酶的研究進展及其化療效果間的關(guān)系〔J〕.中國腫瘤臨床，2005;32(9)：535-53.

〔2013-09-13修回〕

(編輯袁左鳴)