MMP-9/TIMP-1在自發(fā)性高血壓大鼠左室重構(gòu)中的表達及血脂康膠囊的調(diào)控作用

朱桂平王卓1林忠偉

(廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東廣州510080)

摘要〔〕目的探討自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左室重構(gòu)中循環(huán)和心肌金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-9/組織金屬基質(zhì)蛋白酶抑制因子(TIMP)-1的表達和血脂康干預(yù)的效果。方法30只8周齡雄性SHR隨機分為低劑量血脂康組(A組)、高劑量血脂康組(B組)和對照組(C組)，每組10只。另設(shè)Wistar大鼠作為正常組(W組，n=8)。A組和B組分別每日以血脂康20 mg/kg和200 mg/kg生理鹽水溶解后灌胃；連續(xù)8 w。超聲心動圖測定室間隔舒張期厚度(IVSd)和左心室后壁舒張期厚度(LVPWd)；取靜脈血離心后取血清，ELISA法測定一氧化氮(NO)、MMP-9、 TIMP-1濃度，麻醉處死后取左心室，稱重測左室重量指數(shù)(LVWI)，蘇木精-伊紅(H-E)染色，觀察心肌細胞直徑和心肌細胞面積；Van-Gieson染色檢測心肌間質(zhì)膠原纖維表達；免疫組化檢測心肌細胞MMP-9、TIMP-1的蛋白表達。結(jié)果SHR血清NO水平明顯下降，MMP-9、TIMP-1水平、LVWI、IVSd和LVPWd均明顯升高，與W組比較，差異顯著(P<0.05)；血脂康治療后NO水平有所升高，MMP-9 、LVWI水平有所下降，B組與C組比較差異顯著(P<0.05)；但TIMP-1、IVSd和LVPWd水平變化不大(P>0.05)。心肌細胞間膠原纖維經(jīng)Van-Gieson染色顯示C組中大鼠心肌細胞間膠原成分顯著增多；血脂康治療后，A、B組膠原均有所減少，B組膠原纖維數(shù)量分布零散，稀少，與正常大鼠W組相近；免疫組化染色顯示心肌組織MMP-9蛋白水平在C組表達明顯，與W組比較，差異顯著(P<0.05)；而A、B組MMP-9蛋白表達水平較C組有所下降，B組下降最明顯(P<0.05)；心肌組織TIMP-1蛋白表達水平在SHR組升高，與W組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論高血壓左室重構(gòu)出現(xiàn)循環(huán)和心肌MMP-9/TIMP-1表達升高，血脂康早期干預(yù)可下調(diào)MMP-9水平，改善心肌重構(gòu)。

關(guān)鍵詞〔〕心肌肥厚；血脂康；自發(fā)性高血壓大鼠，基質(zhì)金屬蛋白酶

中圖分類號〔〕R544.1〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：廣東省中醫(yī)藥管理局課題(2010198)

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科

第一作者：朱桂平(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事高血壓及冠心病的臨床及介入研究。

左室重構(gòu)與左室肥厚密切相關(guān)，與心肌細胞的肥大、細胞外基質(zhì)膠原蛋白改變均有關(guān)。金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-9是降解細胞外基質(zhì)成分的最主要蛋白水解系統(tǒng)之一，組織金屬基質(zhì)蛋白酶抑制因子(TIMP)-1可內(nèi)源性特異性抑制MMP-9的功能，兩者的相互作用在心室重構(gòu)中起重要作用。他汀類藥物的作用機制主要與其改善內(nèi)皮功能、抗炎等有關(guān)。對內(nèi)皮功能的改善同樣得到不少臨床和基礎(chǔ)實驗證實。內(nèi)皮功能紊亂是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，改善內(nèi)皮功能可影響高血壓心肌肥厚、左室重構(gòu)的進程〔1〕。血脂康膠囊為紅曲源性天然他汀——洛伐他汀，我們在既往研究中已證實其可改善高血壓大鼠的內(nèi)皮功能〔2〕，但是否能改善左室重構(gòu)情況以及在此過程中心肌MMP-9/TIMP-1的表達情況尚不明確，值得進一步探索。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)30只和8周齡雄性Wistar大鼠(W組)8只，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。將SHR隨機分為低劑量血脂康組(A組)、高劑量血脂康組(B組)和安慰劑組(C組)，每組10只。血脂康膠囊由北大維信公司提供。A組每日使用血脂康20 mg/kg生理鹽水溶解灌胃；B組每日使用血脂康200 mg/kg生理鹽水溶解灌胃；C組和W組在同一時間進行同等量生理鹽水灌胃。每周測大鼠體質(zhì)量，隨體質(zhì)量增加調(diào)整給藥量，連續(xù)8 w。實驗前后分別使用安徽正華生物設(shè)備有限公司生產(chǎn)的ZH-HX-Z型無創(chuàng)尾動脈血壓測量系統(tǒng)經(jīng)尾動脈測血壓。

1.2實驗室檢查治療8 w后，經(jīng)靜脈采血，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取血清-20℃冰箱保存待測。采用ELISA方法按試劑盒說明測定各組一氧化氮(NO)濃度及血清MMP-9、TIMP-1水平，NO ELISA試劑盒購自北京鑫方程生物技術(shù)有限公司；MMP-9 ELISA試劑盒由欣博盛生物科技有限公司提供；TIMP-1 ELISA試劑盒由R&D公司提供。

1.3組織學(xué)檢查采血后，取出心臟，沿房室溝剪掉兩心房及主、肺動脈，緊貼室間隔右側(cè)剪除右心室游離壁，剩余部分即為左室(包括室間隔)，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，計算左心室重量指數(shù)(LVWI)=左心室質(zhì)量(LVW，mg)/體質(zhì)量(BW，g)。取下左心室經(jīng)甲醛固定液中固定、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色觀察心肌細胞和間質(zhì)的改變，Van-Gieson染色檢測心肌間質(zhì)膠原纖維表達，采用IPP6.0專業(yè)圖片分析軟件分析膠原容積分數(shù)(CVF)。

1.4免疫組化染色4組心肌組織切片依序取3張分別行MMP-9、TIMP-1免疫組化染色，嚴格按說明書操作。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機取3個高倍視野進行觀察，選取陽性區(qū)域測定灰度值并取平均值，同一組織的3張切片再次取平均值。所用試劑：一抗：MMP-9 抗體 (A-AJ1503b，ABGENT，San Diego，CA)，TIMP-1抗體(A-AO1052a，ABGENT，San Diego，CA)；二抗購于Dako公司。

2結(jié)果

2.1各實驗組一般資料及NO、MMP-9、TIMP-1水平比較治療前、后各組體重?zé)o明顯差異(P>0.05)；8周齡SHR血壓已呈現(xiàn)升高的趨勢，16周齡SHR血壓持續(xù)升高，與同周齡W組比較，差異顯著(P<0.05)；16周齡SHR血清NO水平明顯下降，與W組比較顯著(P<0.05)；血脂康治療后NO水平有所升高，B組與C組比較差異顯著(P<0.05)；16周齡SHR血清MMP-9、TIMP-1水平均明顯升高，與W組比較，差異顯著(P<0.05)。血脂康治療后，MMP-9水平有所下降，B組與C組比較差異顯著(P<0.05)；但TIMP-1水平變化不大，A、B、C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各實驗組間左室肥厚指標(biāo)及心肌細胞間膠原纖維變化與W組比較，16周齡SHR組 LVWI明顯增加(均P<0.05)；與C組比較，B組LVWI降低 (P<0.01)，而A組LVWI雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與W組比較，C組室內(nèi)隔舒張期存度(IVSd)和左心室后壁舒張期存度(LVPWd)增加(P<0.05)；與C組比較，A組和B組IVSd和LVPWd均有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；心肌細胞直徑和心肌細胞面積B組較C組均有下降((P<0.05)，見表2。

Van-Gieson染色后可見心肌細胞染色呈黃色，細胞外間質(zhì)膠原纖維呈紅色；對照組C組中大鼠心肌細胞間膠原成分顯著增多。與C組比較，A、B組膠原均有所減少，B組膠原纖維數(shù)量分布零散、稀少，與正常大鼠W組相近。CVF定量分析可見，A組和C組CVF明顯高于W組(P<0.05)，而B組與W組比較CVF無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖1。

2.3MMP-9、TIMP-1免疫組化染色C組心肌組織MMP-9蛋白表達明顯，與W組比較差異顯著(P<0.05)；而A、B組與C組比較，MMP-9蛋白表達水平有所下降，尤以B組下降最明顯(P<0.05)。A、B、C組心肌組織TIMP-1蛋白表達呈陽性，與W組比較差異顯著(P<0.05)；而A、B、C三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2，圖3。

表1　4組大鼠收縮壓及血清NO、MMP-9、TIMP-1水平的變化

與W組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05

圖1　Van-Gieson染色結(jié)果(×200)

組別nLVWI(mg/g)IVSd(mm)LVPWd(mm)心肌細胞直徑(μm)心肌細胞面積(μm2)A組102.74±0.261)1.08±0.101.30±0.0927.01±6.101)462.75±35.481)B組102.61±0.121)2)1.06±0.121.28±0.1326.12±4.291)2)442.20±23.591)2)C組102.98±0.261)1.19±0.171)1.45±0.261)31.07±4.861)479.32±40.711)W組82.17±0.320.96±0.121.19±0.1821.12±3.60408.07±22.19

與W組比較:1)P<0.05；與C組比較:2)P<0.05

圖2　心肌MMP-9表達比較(×200)

圖3　心肌TIMP-1表達比較(×200)

3討論

高血壓左心室重構(gòu)的病理特征主要包括心肌細胞肥大、心臟成纖維細胞增殖及細胞外基質(zhì)(ECM)沉積，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能重塑。ECM的合成與降解是高血壓心血管重塑的重要特征。與基質(zhì)代謝密切相關(guān)的酶如MMPs及其特異抑制劑TIMP在高血壓左室重構(gòu)中起著十分重要的作用。在正常的心臟組織，大部分的MMPs表達處于低水平，并與其抑制物TIMP共同形成隨時間變化的動態(tài)平衡，維持ECM的穩(wěn)定。MMPs可以介導(dǎo)許多物質(zhì)的活化〔3，4〕，如TNF-α、TGFβ及IL-1β，這些物質(zhì)一方面增加新膠原的合成，破壞心肌細胞；另一方面，可以促使MMPs表達增加，構(gòu)成惡性循環(huán)，進一步加重心室重構(gòu)的過程。對高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠心臟衰竭模型的研究發(fā)現(xiàn)心臟中MMPs活性升高，循環(huán)血液中血清MMPs也升高，主要是MMP-9升高〔5，6〕。對高血壓患者的臨床觀察還發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚組的室間隔及左室后壁矯正的聲學(xué)強度高于非心肌肥厚組，背向散射積分周期變化值低于非肥厚組，而這樣的心肌聲學(xué)密度定量指標(biāo)的變化與血清MMP-9和TIMP-1濃度存在相關(guān)性〔7〕。因此，MMP-9/TIMP-1在高血壓左室重構(gòu)中扮演著重要的作用。

內(nèi)皮功能紊亂是高血壓左室重構(gòu)發(fā)生的重要始動因素，他汀對內(nèi)皮的改善應(yīng)同樣有利于減緩左室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果提示血脂康治療后其內(nèi)皮功能改善的同時心肌肥厚的指標(biāo)相應(yīng)地有一定程度的改善。但這個改變過程和參與心室重構(gòu)的MMP-9/TIMI-1的關(guān)系尚不清楚。Tarin等〔8〕對心肌缺血損傷的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮誘導(dǎo)合酶(iNOS)缺失的小鼠或普通小鼠經(jīng)抗iNOS后，缺血再灌注損傷程度更明顯，主要與這兩類小鼠體內(nèi)ECM金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(EMMPRIN)及MMP明顯增加有關(guān)。對iNOS缺失小鼠使用抗EMMPRIN中和抗體進行治療，可在一定程度上減低缺血再灌注損傷引起的MMP-9表達，并能減低心臟受損的程度，表明NO介導(dǎo)的心臟保護主要是通過對EMMPRIN進行調(diào)節(jié)而起作用的，EMMPRIN可能是NO的下游因子，提示NO和MMP之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系。王士凱等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死(AMI)大鼠經(jīng)氟伐他汀灌胃干預(yù)后與對照組相比，左室舒張末內(nèi)徑、LVMI均降低，心臟組織MMP-9、MMP-10表達明顯降低，左室射血分數(shù)顯著增加。瑞舒伐他汀對未行經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)的AMI患者強化治療后同樣伴隨著血清MMP-9水平明顯下降〔10〕。本文結(jié)果也提示高劑量血脂康對循環(huán)中MMP-9水平和心肌細胞MMP-9蛋白表達均有明顯抑制作用，其跟其他他汀類藥物一樣具有抑制MMPs的作用〔11〕，但對TIMP-1水平影響不大，不排除與干預(yù)療程時間有關(guān)，抑或是其他機制共同參與的綜合表現(xiàn)。

另外，老年大鼠的心臟膠原纖維比例均較青年大鼠顯著增加，提示膠原沉積和膠原重塑也是心肌重構(gòu)及心臟衰老的一個表現(xiàn)，本研究通過V-G染色顯示高血壓大鼠較正常大鼠心肌間質(zhì)的膠原成分明顯增多，高劑量血脂康干預(yù)對心肌間質(zhì)膠原蛋白生成具有抑制作用，說明血脂康與其他他汀類藥物一樣，可改善心肌間質(zhì)膠原重塑〔12～14〕。但其心肌間質(zhì)的變化與MMP-9/TIMI-1的關(guān)聯(lián)程度、MMP-9/TIMP-1的變化是伴隨現(xiàn)象還是因果關(guān)系尚不明確，尚需要更多體內(nèi)和體外的基礎(chǔ)研究進一步探索血脂康膠囊對MMP-9和TIMP-1的上游調(diào)控的信號通路。

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〔2014-10-17修回〕

(編輯李相軍)