宋歡，王貝貝，趙寧，王海霞，孫艷梅，王俊剛，申紅

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003）

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體防御外界病原體侵襲時(shí)產(chǎn)生的由基因編碼、核糖體合成的一類小分子活性多肽，是生物體內(nèi)先天性防御系統(tǒng)的重要組成成分，具有非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒等作用，且不破壞機(jī)體正常細(xì)胞的小分子多肽[1]。目前，已從細(xì)菌、昆蟲、植物和脊椎動(dòng)物，包括人類中分離獲得抗菌肽，其中昆蟲是地球上種類最多、數(shù)量最大的生物類群，其防御系統(tǒng)獨(dú)特，當(dāng)其受到某些物理刺激或微生物感染后，會(huì)引起免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一系列抗菌物質(zhì)?；认x屬于昆蟲，在我國(guó)分布較廣泛。新疆石河子位于蒙新區(qū)的西部，是亞洲飛蝗(Locusta migratoria L.）的聚集地[2]。亞洲飛蝗屬直翅目蝗科，群居性昆蟲，存在獨(dú)特的免疫機(jī)制，但有關(guān)亞洲飛蝗幼蟲抗菌肽的抑菌活性以及特性方面的研究報(bào)道較少。

因此，本研究以亞洲飛蝗幼蟲為材料，在前期研究細(xì)菌誘導(dǎo)蠅蛆24 h產(chǎn)生的抗菌肽濃度較高和強(qiáng)抑菌活性的基礎(chǔ)上，對(duì)其誘導(dǎo)24 h產(chǎn)生的抗菌肽進(jìn)行提取，并對(duì)其部分理化特性進(jìn)行研究，旨在為其作為新型抗生素替代物提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲

亞洲飛蝗由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 菌種

大腸桿菌、葡萄球菌由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑和藥品

甲醛、冰乙酸、氨水、2‰巰基乙醇、35μg/mL苯甲基磺酰氟、無水乙醇、85%磷酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 (用結(jié)晶牛血清白蛋白與純化水配制而成，濃度為100μg/mL)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉、鹽酸溶液等均為分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 亞洲飛蝗抗菌肽誘導(dǎo)

挑選體重相近的亞洲飛蝗幼蟲100只，隨機(jī)分成4組：大腸桿菌誘導(dǎo)組、葡萄球菌誘導(dǎo)組、大腸桿菌和葡萄球菌混合菌誘導(dǎo)組(采用濃度為1×108CFU/mL菌液2μL分別從亞洲飛蝗腹部注射)和對(duì)照組（未處理)。將以上試驗(yàn)組處理的亞洲飛蝗幼蟲置于溫度為25-32℃，相對(duì)濕度為65%-70%的條件下正常飼喂，于飼喂24 h后挑取活的蟲體，以備測(cè)定。

1.2.2 亞洲飛蝗抗菌肽提取

參考朱小奇等[3]的方法，采用乙酸銨緩沖液浸提方法選取不同細(xì)菌誘導(dǎo)的亞洲飛蝗幼蟲，用蒸餾水反復(fù)沖洗，并用75%乙醇消毒，吸干蟲體表面液體，稱量后置于研缽中，按重量/體積比為 1∶3加入提取液 (0.05 mol/L、pH=5的乙酸銨緩沖液，35 μg/mL的苯甲基磺酰氟（PMSF），2‰巰基乙醇)，充分研磨，勻漿液于4℃，12000 r/min離心30 min取上清液，重復(fù)3次，合并上清液，放至100℃的恒溫水浴箱中水浴5 min，然后以4800 r/min在4℃離心30 min，去除變性蛋白，用滅菌注射器抽取不含油層的上清液，裝于小試管中標(biāo)記后放于-20℃冰箱中冷凍備用。

1.2.3 亞洲飛蝗抗菌肽提取液濃度測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定亞洲飛蝗抗菌肽粗提取液的濃度。用分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白（結(jié)晶牛血清白蛋白）OD595值，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），測(cè)定各試驗(yàn)組抗菌肽粗提液OD595值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得亞洲飛蝗抗菌肽粗提液濃度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線Fig.1 Standard protein cure

1.2.4 亞洲飛蝗抗菌肽提取液部分理化特性的測(cè)定

1.2.4.1 熱穩(wěn)定性

將葡萄球菌誘導(dǎo)24 h的亞洲飛蝗抗菌肽提取液分別于 50、60、70、80、90和 100 ℃水浴中加熱10 min，12000 r/min（4℃）離心 15 min，對(duì)每個(gè)溫度組分別收集上清液，使用游標(biāo)卡尺測(cè)定對(duì)葡萄球菌的抑菌直徑，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，未經(jīng)熱處理的樣品為對(duì)照組，將對(duì)照組的抑菌率設(shè)定為l00%。

1.2.4.2 反復(fù)凍融的穩(wěn)定性

將葡萄球菌誘導(dǎo)24 h的亞洲飛蝗抗菌肽提取液置于 -20℃冰箱分別反復(fù)凍融 l、2、4、6、8和 10次，凍融后的提取液于12000 r/min、4℃離心15 min，分別收集上清液，用游標(biāo)卡尺法測(cè)定其對(duì)葡萄球菌的抑菌活性，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以不凍融的樣品作為對(duì)照組，將對(duì)照組的抑菌率定為l00%。

1.2.4.3 不同pH處理對(duì)抗菌肽提取液活性的影響

用鹽酸和氨水配置 pH分別為 1、3、5、7、9的溶液，將這些溶液分別與經(jīng)葡萄球菌誘導(dǎo)的亞洲飛蝗的抗菌肽提取液等體積混合，室溫放置l h后檢測(cè)其對(duì)葡萄球菌的抑菌活性，以加等量生理鹽水的抗菌肽粗提液作對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。未經(jīng)pH溶液處理的樣品為對(duì)照組，將對(duì)照組的抑菌率設(shè)定為l00%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 17.0的One Way ANOVA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異性檢驗(yàn)。蟲，測(cè)定其抗菌肽粗提液濃度，結(jié)果顯示用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及其混合菌誘導(dǎo)亞洲飛蝗24 h的抗菌肽粗提液濃度間差異不顯著，但均高于未經(jīng)誘導(dǎo)的亞洲飛蝗組的濃度，與洛雪等[6]研究“用針刺蘸大腸桿菌可以誘導(dǎo)亞洲飛蝗抗菌物質(zhì)的表達(dá)，并在誘導(dǎo)24 h時(shí)產(chǎn)生的抗菌肽濃度最高”的結(jié)果一致。這提示用不同的細(xì)菌誘導(dǎo)刺激亞洲飛蝗幼蟲均可以使其產(chǎn)生高表達(dá)量的抗菌肽，可能是細(xì)菌引起亞洲飛蝗幼蟲的誘導(dǎo)型表達(dá)屬于適應(yīng)性免疫。

（2）隨著抗菌肽一系列功能活性的不斷發(fā)現(xiàn)，一些直接影響抗菌肽功能活性的理化性質(zhì)也開始受到關(guān)注。Garcia-Olmedo等[7]研究表明，抗菌肽的疏水性增加時(shí)，其抗菌活性也逐漸升高；但當(dāng)疏水性達(dá)到一定程度時(shí)，該肽段將喪失對(duì)真核細(xì)胞與原核細(xì)胞之間的選擇性，繼而對(duì)真核生物也產(chǎn)生毒性。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)亞洲飛蝗幼蟲抗菌肽粗提液的部分理化特性進(jìn)行了研究，用不同溫度處理葡萄球菌誘導(dǎo)亞洲飛蝗幼蟲的抗菌肽提取液對(duì)葡萄球菌抑菌活性的測(cè)定結(jié)果表明，50-70℃處理的亞洲飛蝗抗菌肽的抑菌活性與未經(jīng)熱處理的對(duì)照組間差異不顯著（P＞0.05），而經(jīng)80-100℃處理的抗菌肽提取液顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），溫度為100℃時(shí)的抑菌率仍然為82.65%，這提示亞洲飛蝗抗菌肽可以耐受高溫且具有較好的熱穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)榭咕脑谒苄原h(huán)境中無穩(wěn)定構(gòu)象，只有在結(jié)合上或接近細(xì)胞膜時(shí)才形成其發(fā)揮功能的高級(jí)結(jié)構(gòu)[3]。

（3）亞洲飛蝗抗菌肽粗提液反復(fù)凍融的試驗(yàn)結(jié)果顯示，凍融6次以內(nèi)的抗菌肽與對(duì)照組 (未經(jīng)凍融)差異不顯著（P＞0.05），凍融8-10次的抗菌肽抑菌活性低于對(duì)照組（P＜0.05），這提示隨著凍融次數(shù)的增多，亞洲飛蝗抗菌肽粗提液的抑菌活性逐漸減小，但其凍融10次抑菌率仍在77%以上。由此可見，少次數(shù)的反復(fù)凍融不會(huì)對(duì)亞洲飛蝗抗菌肽的活性產(chǎn)生顯著影響。這提示亞洲飛蝗抗菌肽可能有耐受低溫和反復(fù)凍融特性。

（4）據(jù)報(bào)道大多數(shù)昆蟲抗菌肽顯堿性，其等電點(diǎn)大于7[8-9]。本試驗(yàn)對(duì)亞洲飛蝗抗菌肽粗提液經(jīng)不同pH溶液處理，結(jié)果顯示經(jīng)pH酸性溶液處理時(shí)，亞洲飛蝗抗菌肽對(duì)葡萄球菌抑菌活性較好，pH為7時(shí)的抑菌率達(dá)到了92.97%，但隨著pH值的增加，溶液過堿會(huì)影響抗菌肽的活性（P＜0.05）。這提示亞洲飛蝗抗菌肽具有一定的抗酸堿性能。

對(duì)亞洲飛蝗抗菌物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)及其部分理化特性的研究結(jié)果表明，亞洲飛蝗抗菌肽具有耐高溫和耐酸堿等較穩(wěn)定的生物學(xué)特性，抑菌效果好。本研究可為其今后在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考，而對(duì)于其結(jié)構(gòu)、功能和抗菌機(jī)理還需要更深入的研究。

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