袁哈利 ，郝曉云 ，鄭學偉 ，李鴻彬 ，2

（1石河子大學生命科學學院，石河子832003；2石河子大學農業(yè)生物技術重點實驗室，石河子832003）

黃萎病是棉花生產上危害嚴重的病害之一。黃萎病是土傳性維管束病害，其致病菌主要有2種即大麗輪枝菌[1-2]和黑白輪枝菌[3]，棉花黃萎病病萎癥狀的產生是由于木質部導管被菌絲和繁殖的孢子堵塞和病原菌產生的毒素共同作用的結果。近年來，黃萎病在我國各棉區(qū)屢次大面積發(fā)生，給棉花產業(yè)造成極大損失[4-5]。因此，研究黃萎病致病機制，進一步利用遺傳工程手段培育抗病品種具有重要意義和廣闊的應用前景。

植物GDSL脂肪酶是一個大的基因家族，在植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、油脂代謝和防御反應等[6-8]生理活動中發(fā)揮重要的生物學功能。GDSL脂肪酶基因的表達能夠響應生物和非生物脅迫。植物GDSL脂肪酶基因的表達可被病菌、水楊酸、乙烯、茉莉酸等激素以及非生物脅迫因子所誘導，表明他們可能參與植物抗病和應激反應[9-11]。GDSL脂肪酶可以通過信號傳導調節(jié)或者直接破壞真菌孢子的完整性，限制病原菌在感染地方生長繁殖[9，12]。在抗病研究中，植物細胞內的許多保護酶如過氧化氫酶（Catalase,CAT）、超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（Peroxidase,POD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyas）和多酚氧化物酶（Polyphendoxidas,PPO）與植物的抗病能力有著密切的關系[13-15]。

棉花作為重要的經濟作物，GDSL脂肪酶與黃萎病相關的研究少有報道。本研究從棉花中克隆了1個GDSL脂肪酶基因GhGLIP，對其在受到黃萎病脅迫時的表達調控進行了初步分析；利用大麗輪枝菌菌對野生型擬南芥和轉基因擬南芥葉片分別處理，對轉基因擬南芥植株對黃萎病菌的抗性進行了研究；對棉花GhGLIP抗黃萎病菌的機制進行分析，以期為進一步抗病品種培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

大麗輪枝菌（黃萎病菌）、哥倫比亞野生型Col-0擬南芥為本實驗室保存，經過處理的葉片材料經液氮速凍，于-80℃冰箱保存待用。

1.1.2 試劑

RNA反轉錄試劑盒購自大連寶生物公司；對硝基苯酚棕櫚酸酯購自上海銘睿生物科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.1.3 試驗儀器

Eppendorf PCR儀、Eppendorf 5424R型離心機：Eppendorf North America；HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Tannon Epson100型核酸電泳儀：上海天能設備有限公司；ZF-158型凝膠成像分析系統：上海金鵬分析儀器有限公司；ZSD-A1270A恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY-100B恒溫搖床：上海智誠分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

RNA所用的EP管、槍頭、槍頭盒、試劑瓶等經過DEPC水處理24 h，高壓滅菌處理后使用，研缽和鑰匙經180℃烘烤6 h后備用，采用Trizol方法提取擬南芥總RNA。

1.2.2 RNA反轉錄合成cDNA

用反轉錄試劑以擬南芥RNA為模板反轉錄成cDNA。以獲得的cDNA為模板進行RT-PCR分析。RT-PCR所用引物從GenBank EST數據庫獲得片段序列信息，Primer 5設計上下游引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，序列見表1。

表1 使用的引物序列Tab.1 List of primer sequences

1.2.3 黃萎病菌（大麗輪枝菌）接種處理

參考李泉木等[16]的方法，將培養(yǎng)好的黃萎病菌配成孢子濃度為1×107個/mL的懸浮液。用接種針在4周大轉基因擬南芥和野生型擬南芥子葉葉脈周圍刺傷葉片，刺15次/cm2，每個葉片接種10μL孢子懸浮液，用對照用水處理。每棵植株處理3片子葉，每一處理設置6棵植株作為重復。在22℃、光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度約為6000 lx，60%相對濕度的條件下培養(yǎng)。

1.2.4 細胞壞死染色

將接種過黃萎病菌48 h的葉片，置于DAB（1 mg/mL，pH=3.8）中染色 12 h，用比例為無水乙醇：乙酸∶甘油∶水=8∶1∶1∶1的脫色液在37℃脫色24-48 h，將葉片放在干凈的載玻片上，將Trypan blue染液均勻滴于葉面上，蓋上蓋玻片并靜置20 min，用光學顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 酶活性測定

脂肪酶活性測定：采用馬斯亮藍G-250法測定蛋白含量，用牛血清蛋白制作6個梯度的標準曲線，制標準曲線。

酶活性分析：反應液中PBS pH7.0 50 mol/L，對硝基苯酚月桂酸酯1 mol/L，異丙醇5%，蛋白50 μg，37℃反應15 min，100℃加熱2 min，冷卻至室溫后，在405 nm處測定吸光度值。

脂肪酶活力計算公式：

酶活力 =△A405×V×K×1000/（T×ε×m）(mmol/min·mg protein)。

其中，A：反應液吸光度；V：反應液體積（mL）；K：稀釋倍數；T：反應時間（min）；ε=0.016(μmol/L)-1；m：蛋白含量（mg）。

采用紫外吸收法測定CAT活性，采用NBT法測定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性；PAL活性測定參考Southern等[17]的方法；PPO活性測定參考薛應龍[18]的方法。

利用SPSS進行F檢測分析各酶活性之間的差異性，利用Origin進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 黃萎病菌處理轉GhGLIP基因擬南芥的表型分析

用大麗輪枝菌處理轉GhGLIP基因擬南芥和野生型擬南芥植株葉片。由圖1可見：野生型擬南芥處理1 d后，葉片略微有些萎蔫，處理3 d后，葉片萎焉嚴重，且出現較多壞死斑，轉GhGLIP基因植株葉片僅產生少量壞死斑，無萎縮現象（圖1A）。用DAB-臺盼藍染色定量分析其細胞死亡情況，統計分析顯示，野生型擬南芥葉片細胞出現大面積死亡，死亡面積達59.05%；轉基因擬南芥葉片細胞死亡較少，死亡面積僅11.38%（圖1B）。結果表明，GhGLIP增強了擬南芥對黃萎病菌的抗性。

圖1 轉GhGLIP基因擬南芥葉片對黃萎病菌處理的表型分析Fig.1 Phenotype analyses of GhGLIP transgenic Arabidopsis leaves treated by Verticillium dahlia

2.2 轉GhGLIP基因擬南芥的脂肪酶活性分析

分析結果見圖2。

圖2 GDSL脂肪酶響應黃萎病菌處理的表達分析Fig.2 The expression activity analyses of GDSL lipase responding to Verticillium dahlia

由圖2可見，轉GhGLIP基因擬南芥和野生型擬南芥受到黃萎病菌（大麗輪枝菌）侵染后，脂肪酶活性呈現逐漸增強的趨勢，在接菌3 d后達到最高值，而后表達逐漸趨于恒定，暗示GDSL脂肪酶與擬南芥響應抵抗大麗輪枝菌具有密切關系。

2.3 轉GhGLIP基因擬南芥的抗氧化系統酶活性分析

由圖3可見：利用水或黃萎病菌處理后，CAT的表達變化不顯著；但是與野生型擬南芥相比，在水或黃萎病菌處理后，轉基因擬南芥中CAT的表達均高于野生型擬南芥。

黃萎病菌處理后，POD和SOD的表達具有相似性，均受到了病菌的誘導表達，并且轉基因擬南芥中POD的表達高于野生型擬南芥。

圖3 黃萎病菌處理后擬南芥葉片抗氧化酶的表達分析Fig.3 Analyses of the expression activity of Arabidopsis leaves antioxidases under treatment of Verticillium dahliae

2.4 轉GhGLIP基因擬南芥中PAL和PPO的表達分析

由圖4可見：黃萎病菌處理1 d后，PAL受到了快速的響應和誘導表達，在處理3 d后達到最高值，隨后表達趨于穩(wěn)定；轉基因擬南芥中PAL的表達高于野生型。PPO活性在黃萎病菌處理3 d后達到最高值，其響應速度略低于PAL。這說明PAL和PPO在擬南芥響應病菌處理過程中發(fā)揮重要作用，PAL的響應更為快速。

圖4 黃萎病菌處理后擬南芥葉片PAL和PPO的表達分析Fig.4 The expression activity analyses of Arabidopsis leaves PAL and PPO under treatment of Verticillium dahliae

2.5 GhGLIP誘導病程相關基因和乙烯信號傳遞相關基因的表達

分別取接種黃萎病菌轉GhGLIP基因植株0、1、3、5、7 d后的葉片材料，以水處理為對照，提取總RNA并反轉錄成cDNA，以Actin基因為參照，檢測病程相關防衛(wèi)基因和乙烯信號轉導相關基因的表達。與水處理的各材料相比，黃萎病菌處理轉基因植株葉片中病程相關防衛(wèi)基因PDF1.2和PR1，以及乙烯信號傳遞相關基因ERF1和EIN3基因的表達獲得了顯著的誘導，并且在處理1 d時有顯著增加，在處理3 d時達到最大值，隨后一直保持穩(wěn)定表達（圖5）。結果表明，轉GhGLIP基因擬南芥抗黃萎病菌的能力增強，可能與病程相關防衛(wèi)基因表達的增強，以及乙烯信號的作用有著密切關系。

圖5 黃萎病菌處理后防御基因和乙烯信號轉導基因的表達分析Fig.5 Expression levels of defense genes and ethylene signal transduction genes under treatment of Verticillium dahliae

3 討論

（1）植物GDSL脂肪酶能夠參與生物和非生物脅迫下的抗逆反應。擬南芥中的一種分泌蛋白GLIP1能夠激發(fā)植物局部和系統的抗性，重組表達的GLIP1蛋白可以直接破壞真菌孢子的完整性，從而抑制十字花科黑斑病菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌和丁香假單胞菌等真菌的生長繁殖。辣椒中的GDSL脂肪酶基因CaGLIP1受到脅迫因子的誘導表達，轉CaGLIP1基因擬南芥的GDSL脂肪酶活性顯著提高，并且對生物和非生物脅迫的抗性增強[9，19]。本研究將從陸地棉中獲得1個GDSL脂肪酶基因GhGLIP轉化哥倫比亞野生型擬南芥，對獲得的轉基因擬南芥植接種黃萎病菌處理，轉基因擬南芥中GDSL脂肪酶的表達受到了誘導，轉基因擬南芥的抗病性顯著增強。轉基因擬南芥中抗氧化系統酶如CAT、SOD和POD，以及PAL和PPO的均能快速響應黃萎病菌處理并具有較高的誘導表達，表明這些酶表達在病菌響應過程中起著重要作用。

（2）植物GDSL脂肪酶響應脅迫發(fā)揮其功能時，有時需要激素的誘導和調控。乙烯是誘導對病原物防衛(wèi)反應的重要信號轉導分子[20-22]。擬南芥GLIP1蛋白可通過乙烯信號的誘導產生系統抗性，增強對多種病原菌和細菌的抗性[20-21，23-24]。擬南芥GLIP2蛋白在SA、JA和ET的信號誘導下表達，抑制歐文氏菌的生長[20]。本研究中，在黃萎病菌處理后，轉基因擬南芥中的乙烯信號轉導基因在轉錄水平的表達有顯著提高，細胞內的防御基因PDF1.2和PR1的表達也因受到誘導而增加，但是乙烯信號轉導基因的表達更為顯著，暗示GLIP基因和乙烯之間的關系密切，以及它們在黃萎病菌響應過程中起著重要作用。

植物的抗病響應是一個復雜的過程，涉及到眾多的生理過程，本研究為抗病分子機制解析和進一步的基因工程利用奠定了良好的基礎。

[1] 房衛(wèi)平，祝水金，季道藩.棉花黃萎病菌與抗黃萎病遺傳育種研究進展[J].棉花學報，2001，13(2)：116-120.Fang Weiping，Zhu Shuijin，Ji Daopan.Advanced in researches on inheritance of Verticillium dahlia Kleb.and resistance breeding in cotton[J].Cotton Science，2001，13(2)：116-120.

[2] 丁笑聲，與廣麗.棉花黃萎病及其抗病育種的研究[J].生物技術.2005，15(1)：96-97.Ding Xiaosheng，Yu Guangli.Research of Verticillium wilt and breeding about disease-resistant cotton[J].Biotechnology，2005，15(1)：96-97.

[3]Wang J Y，Cai Y，Gou J Y.VdNEP，an elicitor from Verticllium dahliae，induces cotton plant wilting[J].Appl Environ Microbiol，2004，70（8）：4989-4995

[4] 王崇桃.新疆棉花生產可持續(xù)發(fā)展中的問題與對策[J].石河子大學學報：自然科學版，1999，3(2)：101-106.Wang Chongtao.Problems and countermeasures of the sustainable development of cotton production in Xinjiang[J].Journal of Shihezi University:Natural Science，1999，3(2)：101-106.

[5] 韓盛，向本春.植物病毒分子檢測方法研究進展[J].石河子大學學報：自然科學版，2006，24(5)：550-553.Han Sheng，Xiang Benchun.Advances of methods for the molecular detection of plant virus[J].Journal of Shihezi University:Natural Science，2006，24(5)：550-553.

[6]Kondou Y，Nakazawa M，Muto S，et al.，RETARDED GRO WTH OF EMBR YO1，a new basic helix-loop-helix protein，expresses in endosperm to control embro growth[J].Plant Physiol，2008，147：1924-1935.

[7]Takahashi K，Kondo M，Shimada T，et al.Ectopic expression of an esterase，which is a candidate for the unidentified plant cutinase，causes cuticular defects in Arabidopsis thaliana[J].Plant and Cell Physiology，2010，51(1)：123-131.

[8] 郝曉云，袁哈利，李鴻彬，等.過量表達棉花GDSL脂肪酶提高甘藍型油菜油脂含量的研究[J].中國糧油學報，2014，29(6)：63-68.Hao Xiaoyun，Yuan Hali，Li Hongbin，et al.Overexpression of a cotton GDSL lipase increases the oil content of Brassica napus L.[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2014，29(6)：63-68.

[9]Oh I S，Sun J K.Secretome analysis reveals an arabidopsis lipase involved in defense against Alternaria brassicicola[J].The Plant Cell，2005，17，2832-2847.

[10]Kram B W，Perera M A，Carter C，et al.Identification，cloning and characterization of a GDSL lipase secreted into the nectar of Jacaranda mimosifolia[J].Plant Mol Biol，2008，68：173-183.

[11]Lee K，Cho T.Characterization of a salicylic acid-and pathogeninduced lipaselike gene in Chinese cabbage[J].Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2003，36(5)：433-441.

[12]Sun J K，Hak C J，Ohkmae K P，et al.GDSL lipase-like 1 regulates systemic resistance associated with ethylene signaling in Arabidopsis[J].The Plant Journal，2009，58，235-245.

[13]程璐，賀春貴，胡桂馨，等.苜蓿斑蚜危害對5種苜蓿品種(系)PAL、POD、PPO酶活性的影響[J].植物保護，2009，35(6)：87-90.Cheng Lu，He Chungui，Hu Guixin，et al.The effects of Therioaphis trifolii on the activities of PAL，POD and PPO in five alfalfa varieties[J].Plant Protection，2009，35(6)：87-90.

[14]辛建華，傅振清.苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶與甜瓜抗枯萎病的關系[J].石河子大學學報：自然科學版，1997，1(1)：47-50.Xin Jianhua，Fu Zhenqing.Relation of plant phenylalanine(PAL)and ployphenol oxidase(PPOD)and resistance of Hami-muskmelon to Fusarium oxysporum F.SP.Melonis[J].Journal of Shihezi University:Natural Science，1997，1(1)：47-50.

[15]孫黎，肖璐，閻平，等.黎科12種鹽生植物SOD活性及其同工酶的初步研究[J].石河子大學學報：自然科學版，2004，22(6)：500-503.SUN Li，XIAO Lu，YAN Ping，et al.Studies on the activity and isozyme of superoxide dismutase in Chenopodiacea soline species[J].Journal of Shihezi University:Natural Science，2004，22(6)：500-503.

[16]李泉木，朱筠，曹越平.發(fā)根農桿菌侵染大豆產生發(fā)根的研究[J].上海交通大學學報，2012，30(1)：54-60.Li Quanmu，Zhu Jun，Cao Yueping.Hairy root induced by agrobacterium rhizogenes in soybean[J].Journal of Shanghai Jiaotong University，2012，30(1)：54-60.

[17]Southern S G，Deverall B J.Changes in phenylalanine ammonia lyase and peroxidase activities in wheat cultivars expressing esistance to the leaf rust fungus(Puccinia reconditaf.sp.tritici)[J].Plant Pathology，1990，39：223-230.

[18]薛應龍.植物生理實驗[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學出版社，2004：4-49.

[19]Lee D，Kim B，Kwon S，et al.Arabidopsis GDSL lipase2 plays a role in pathogen defense via negative regulation of auxin signaling[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，379(4)：1038-1042.

[20]Hye G K，Sun J K，Jang Y J，et al.，GDSL LIPASE1 modulates plant immunity through feedback regulation of ethylene signaling[J].Plant Physiology，2013，163：1776-1791.

[21]Chang C.The ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis：an emerging paradigm?[J].Trends Biochem Sci，1996，21：129-133.

[22]Thomma B P H J，Eggermont K，Tierens K F M J，et al.Requirement of functional ethylene-insensitive2 gene for efficient resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea[J].Plant Physioogy，1999，121：1093-1101.

[23]Hong Y W，Wang T W，Thompson J E，et al.An ethyleneinduced cDNA encoding a lipase expressed at the onset of senescence[J].PNAS，2000，15(97)：8717-8722.

[24]Bleecker A B，Hans K.Ethylene：a gaseous signal molecule in plants[J].Annual Rev Cell Develop Biol，2000,6:1-18.