周潔靜，侯銀臣，劉旺旺，李桂誼，楊公明

(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東廣州，510640)

免疫活性肽是指一類存在于生物體內具有免疫功能的多肽。該類肽結構多樣，是一種細胞信號傳遞物質，它通過內分泌、旁分泌、神經(jīng)分泌等多種作用方式行使其生物學功能，溝通各類細胞間的相互聯(lián)系。

近年來，有從各種微生物、動物、植物、乳源蛋白中采用酶解方法獲得免疫活性肽的報道，如雞蛋清［1-2］、牛乳酪蛋白［3］、魚蛋白［4-5］、大豆蛋白［6-7］、小麥蛋白［8］、玉米胚芽蛋白［9］等。研究較多的免疫活性肽有抗菌肽、阿片肽、胸腺肽、酪蛋白磷酸肽、血管活性腸肽等［10］。酶制劑的種類及酶解條件對產物的成分、含量、活性起決定性作用。

胎盤含有免疫球蛋白、膠原蛋白、雌激素、腎上腺分泌的激素、干細胞生長因子、白細胞介素、轉化生長因子等生物活性因子，具有抗氧化、免疫、修復組織損傷等功能作用。

我國是世界第一養(yǎng)羊大國，羊資源豐富，每年可以開發(fā)利用的羊胎盤潛藏量高達450萬個，但是絕大多數(shù)都廢棄扔掉，加工量不到3%，造成巨大的資源浪費，且污染了環(huán)境。本研究在提取羊胎盤活性物的基礎上，以單獨刺激指數(shù)作為評價指標，采用復合酶解技術利用羊胎盤提取殘余物制備免疫活性肽，并在單因素優(yōu)化基礎上，應用響應面法優(yōu)化制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊胎盤，山羊分娩的羊胎盤;風味蛋白酶(3.97×103U/g)，中性蛋白酶(4.69×103U/L)，購自諾維信中國銷售代理廣州明曜公司;ICR小鼠，5～6周齡小鼠，購自偉倫體校動物試驗研究中心;RPMI(roswell park memorial institute)-1640基礎培養(yǎng)液，購自上海立菲生物技術有限公司;D-Hank’s洗液，購自上海立菲生物技術有限公司;青霉素、鏈霉素混合液，購自上海立菲生物技術有限公司;小牛血清，購自上海立菲生物技術有限公司;MTT，購自美國Amresco公司;臺盼蘭粉末，購自美國Sigma-Aldrich貿易有限公司;ConA，購自美國Sigma-Aldrich貿易有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

PHS-3D pH計，上海精密科學儀器有限公司;KDN-04A凱氏定氮儀，上海洪紀儀器設備有限公司;日立氨基酸分析儀，L-8800日本日立有限公司;85-2A恒溫磁力攪拌器，常州博遠實驗分析儀器廠;SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司;Anke TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠;SW-CJ-1F凈化工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;96孔細胞培養(yǎng)板，無錫耐思生物科技有限公司;2300-001L多模式微孔板檢測儀，美國Perkin Elmer公司;CO2培養(yǎng)箱，美國Shellab公司;XSP-15C倒置生物顯微鏡，上海長方光學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料的預處理

(1)對分娩的羊胎盤立即收集并低溫超速凍保藏，入-20℃冷庫備用。(2)羊胎盤冷凍粉碎、液氮打漿。(3)pH 7.5的磷酸緩沖液在料液比1∶5、溫度20℃的條件下攪拌提取2 h，在4 000 r/min，4℃條件下離心20 min，收集上清液，沉淀為羊胎盤下腳料作為制備免疫肽的酶解原料。

1.3.2 免疫肽制備工藝

羊胎盤原料→冷凍粉碎→液氮打漿→提取水溶性蛋白→離心收集羊胎盤提取殘余物→復合酶解→滅酶→離心→酶解液

1.3.3 酶解工藝條件的單因素試驗

1.3.3.1 不同酶添加量對小鼠脾細胞增值活性的影響

酶添加量設為 2 000，4 000，6 000，8 000，10 000 U/g蛋白，按中性蛋白酶與風味蛋白酶復配比1∶1，酶解時間3 h，酶解溫度50℃，pH 7.0，料液比1∶50(g∶mL)進行酶解，測定酶解液的單獨刺激指數(shù)。

1.3.3.2 不同復配比對小鼠脾細胞增值活性的影響

中性蛋白酶與風味蛋白酶復配比設為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，按酶添加量 4 000 U/g 蛋白，酶解時間3 h，酶解溫度 50℃，pH 7.0，料液比 1∶50(g∶mL)進行酶解，測定酶解液的單獨刺激指數(shù)。

1.3.3.3 不同酶解時間對小鼠脾細胞增值活性的影響

酶解時間設為 2，3，4，5，6 h，按酶添加量 4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶與風味蛋白酶復配比1∶1，酶解溫度50℃，pH 7.0，料液比1∶50(g∶mL)進行酶解，測定酶解液的單獨刺激指數(shù)。

1.3.3.4 不同酶解溫度對小鼠脾細胞增值活性的影響

酶解溫度設為 40，45，50，55，60℃，按酶添加量4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶與風味蛋白酶復配比1∶1，酶解時間3 h，pH 7.0，料液比 1∶50(g∶mL)進行酶解，測定酶解液的單獨刺激指數(shù)。

1.3.3.5 pH值對小鼠脾細胞增值活性的影響

中性蛋白酶與風味蛋白酶的最適pH值均為7.0［11-12］，因此酶解pH選擇2種酶的最適pH 7.0。

1.3.3.6 料液比對小鼠脾細胞增值活性的影響

料液比設為1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70 g 蛋白/ml，按酶添加量4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶與風味蛋白酶復配比1∶1，酶解時間3h，酶解溫度50℃，pH 7.0，測定酶解液的單獨刺激指數(shù)。

1.3.4 酶解工藝條件的響應面試驗設計

在考察了酶添加量、復配比、酶解時間、酶解溫度、料液比等單因素的基礎上，通過Box-Behnken design(BBD)試驗設計法，選定酶添加量、復配比、酶解時間3個因素作為目標變量，試驗因素及水平如表1所示。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and Levels for the traial

1.3.5 小鼠脾細胞增值活性測定

參考MTT法，并對其進行一定改良后用于實驗。無菌獲取小鼠脾細胞，活細胞比例95% 以上，調整濃度至2×106個/mL;在96孔板中設空白組、對照組和樣品組，3組分別為細胞溶液、細胞 +ConA溶液、細胞 +ConA+樣品溶液。各組均設3個平行，置于含5%CO2，37℃中培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h加入10 μL無菌MTT溶液，繼續(xù)孵育至結束;取出培養(yǎng)板，充分離心后，棄上清，加入150 μL DMSO溶液充分溶解結晶;于517 nm波長處采用酶標儀測其OD值。細胞增值活性以單獨刺激指數(shù)(SI)表示。

1.3.6 水解度(DH)的測定［13-15］

采用茚三酮比色法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗各值均為3個平行數(shù)據(jù)的均值，響應面試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析等。

2 結果與分析

2.1 羊胎盤提取殘余物的生化指標(表2)

表2 羊胎盤提取殘余物Table 2 Composition of the precipitation

2.2 單因素試驗的細胞增值活性

檢測樣品免疫活性時，陽性對照組SI值為0.044±0.002。

2.2.1 不同酶添加量對小鼠脾細胞增值活性的影響

由圖1可知，羊胎盤酶解液對小鼠脾細胞增值活性，在2 000～8 000 U/g隨著酶添加量的增加而增強。但當酶添加量超過8 000 U/g蛋白時，SI值卻下降。

圖1 不同酶添加量對SI值的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on stimulation index

這可能是由于酶添加量小于8 000 U/g蛋白時，底物與酶的濃度比仍未飽和，增加酶添加量，可加快酶解進程，產生更多的羊胎盤免疫活性肽。而當酶添加量繼續(xù)增大到10 000 U/g蛋白時，底物濃度相對較低，酶分子過于飽和，所以水解程度變化不大，免疫活性肽的量不再增加。相反，過量的酶會把具有免疫活性的肽進一步水解為更小分子質量肽或氨基酸，導致最終產物的目標免疫活性SI值下降?？芍瑥秃厦讣尤胱罴阎禐? 000 U/g蛋白。

2.2.2 不同復配比對小鼠脾細胞增值活性的影響

由圖2顯示，隨著中性蛋白酶與風味蛋白酶復配比的增大，其SI值先緩慢下降，當復配比為1∶1時，SI值最少為0.045。繼續(xù)增大復配比，SI值快速上升。當復配比為2∶1時，SI值最大達0.170。復配比與酶解液的SI值并沒明顯的相關關系，這可能與蛋白酶的酶切位點有關。

圖2 不同復配比對SI值的影響Fig.2 Effect of complex interactions on stimulation index

2.2.3 不同酶解時間對小鼠脾細胞增值活性的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，酶解產物的SI值先增大后減少，當酶解時間為5 h時，產物的SI值達最高值為0.181。酶解時間控制5 h內，酶解產物中蛋白質逐漸被分裂成肽，反應體系中存在大分子蛋白，具有免疫活性的肽和氨基酸，這些成分在復合蛋白酶的作用下發(fā)生變化，這個過程比較復雜，存在多種轉化方式，但是酶解時間過長，SI值下降，可能由于隨著酶解的進行，復合蛋白酶切斷了具有高免疫活性的肽鏈，導致產物的SI值下降。因此需要合理控制酶解反應的時間。

圖3 不同酶解時間對SI值的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on stimulation index

2.2.4 不同酶解溫度對小鼠脾細胞增值活性的影響

由圖4可知，酶解溫度為45℃時，酶解產物具有較高的SI值。這與中性蛋白酶和風味蛋白酶的最適溫度有關。中性蛋白酶和風味蛋白酶的最適溫度分別為45℃和55℃［11-12］，而在此溫度下，產物的 SI值較高，45℃時，SI值最高。可能中性蛋白酶更有利于羊胎盤免疫活性肽的生成，因此在中性蛋白酶最適酶解溫度下，產物的活性最高。同時，考察復配比對小鼠脾細胞增值活性的影響時，當中兩者的復配比為2∶1或3∶1時，產物的 SI值均高于復配比為 1∶3或1∶2，進一步也說明中性蛋白酶更有利于羊胎盤免疫活性肽的制備。

圖4 不同酶解溫度對SI值的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on stimulation index

2.2.5 不同料液比對小鼠脾細胞增值活性的影響

由圖5 可知，料液比在 1∶30 ～1∶50(g∶mL)時，SI值總體呈上升;單料液比大于1∶50(g∶mL)時，SI值開始下降?？赡茈S著料液比的增加，底物逐漸由濃稠狀變稀釋，有利于蛋白酶與底物充分接觸，提高酶解效率，產生更多具有免疫活性的肽，但是隨著料液比越來越大，底物過于稀釋，大量的水反而增加了蛋白酶與底物的接觸難度，導致體系酶解不完全，蛋白質難以被分解成具有免疫活性的肽。何佳易［16］等研究表明酶解程度與底物質量濃度有關，為本實驗數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。

圖5 不同料液比對SI值的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on stimulation index

2.3 響應面法優(yōu)化羊胎盤免疫活性肽的工藝

2.3.1 響應面試驗結果

響應面試驗設計及響應值見表3，利用Design Expert8.0對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及對模型進行方差分析，分析結果如表4所示。

表3 響應面設計方案以及響應值Table 3 Experiment design and result of response surface method analysis

表4 響應面方差分析表Table 4 Variance analysis of regression equation

續(xù)表4

各因素經(jīng)二次多項回歸擬合后，得到單獨刺激指數(shù)SI對酶添加量、復配比和酶解時間的二次多項回歸方程:單獨刺激指數(shù)=-0.16+3.04A+0.071B+0.18C-1.03AB+8.31AC+7.66BC-1.07A2-0.022B2-0.028C2。該模型的P＜0.000 1，表明模型方程極顯著，不同處理間的差異極顯著;失擬項P=0.329 2＞0.05，差異不顯著，說明殘差由隨機誤差引起;模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.950 7，即該模型能解釋95.07%的響應值變化;復相關系數(shù)為 R=0.950 7，說明該模型擬合程度良好，實驗誤差小，可以用此模型分析和預測羊胎盤免疫肽。

由顯著性檢驗可知，模型的單項A，二次項A2、B2、C2，交互項AC極顯著;單項 C，交互項 AB顯著;單項B，交互項BC不顯著。各因素對單獨刺激指數(shù)影響的大小依次為酶添加量(A)、酶解時間(C)、復配比(B)。

2.3.2 響應面試驗交互因素分析

從所得響應面分析圖中可以看出響應值與各影響因素的關系，分析出各因素之間的相互作用，如圖6～圖8所示。

由圖6～圖8響應面和等高線圖分析可知，復配比和酶解時間交互作用對單獨刺激指數(shù)的影響最顯著，其次酶添加量和復配比交互作用對單獨刺激指數(shù)的影響顯著。相比較而言，復配比和酶解時間的交互作用稍弱。

圖6 酶添加量和復配比交互作用對單獨刺激指數(shù)影響的響應面圖和等高線Fig.6 Response surface and contour plot of stimulation index of enzyme addition and complex interactions

2.3.3 模型驗證試驗

從上述回歸方程可知，制備羊胎盤免疫肽最優(yōu)工藝條件為:酶添加量2 007.65 U/g，復配比1.75∶1，酶解時間3.7 h?？紤]到實際操作將其工藝條件優(yōu)化為:酶添加量2 500 U/g，復配比1.75∶1，酶解時間4 h。在此條件下進行3次驗證試驗，酶解液的水解度平均值為39.60%，單獨刺激指數(shù)平均值為0.261 2，理論值與實際值的誤差不超過1.21%，結果表明，該模型可以較好地反映出羊胎盤免疫肽的最佳制備條件。

圖7 酶添加量和酶解時間交互作用對單獨刺激指數(shù)影響的響應面圖和等高線Fig.7 Response surface and contour plot of stimulation index of enzyme addition and time

圖8 復配比和酶解時間交互作用對單獨刺激指數(shù)影響的響應面圖和等高線Fig.8 Response surface and contour plot of stimulation index of complex interactions and time

3 結論

通過酶解法制備羊胎盤免疫肽，在單因素試驗基礎上，運用響應面法對制備羊胎盤免疫肽的酶添加量、復配比和酶解時間進行優(yōu)化，得到酶解制備羊胎盤免疫肽的最佳工藝條件為:酶添加量2 500 U/g蛋白，復配比1.75∶1，酶解時間4 h。在此條件下，酶解液的水解度平均值為39.60%，單獨刺激指數(shù)平均值為0.261 2，較陽性對照增加494%。結果表明通過優(yōu)化提高羊胎盤酶解產物的免疫活性。

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