杜永華，敖光輝，魏琴，曾月，李玉杰

1(宜賓學(xué)院香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644000)

2(內(nèi)江師范學(xué)院，四川內(nèi)江，641112)3(宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓，644000)

4(宜賓學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，四川宜賓，644000)

植物多糖是植物體內(nèi)廣泛存在的生物活性物質(zhì)，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗病毒、降血脂等生物活性外，還具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗疲勞作用，日益成為食品科學(xué)、天然藥物、生物化學(xué)與生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。油樟［Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao］是我國特有的樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物樹種［1］，其葉富含揮發(fā)油，比同屬植物香樟［Cinnamomum.camphora(Linn.)Presl］葉含油量高1～2倍，是香料、食品、醫(yī)藥、日用和化工產(chǎn)品的重要原料來源［2］。研究表明，香樟葉除含有揮發(fā)油外，還含有多糖、黃酮、生物堿、多酚等生物活性成分［3-4］，其多糖成分含量豐富，冬季干葉片多糖含量達(dá)116.55 mg/g，具有一定抗氧化活性［3，5］。油樟葉在提取揮發(fā)油后的殘?jiān)崛∥锞哂锌刮⑸铮?］、抗癌［7］、抗炎［8］和鎮(zhèn)痛［9］作用。然而，目前對(duì)油樟葉中多糖成分的提取及其抗氧化活性研究未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選油樟葉多糖的提取工藝，并對(duì)其體外抗自由基活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

油樟(C.longepaniculatum)葉，采摘于四川省宜賓市翠屏區(qū)邱場鄉(xiāng)油樟種植基地;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自貴州迪大生物有限公司，含量≥98%;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH］梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油樟葉預(yù)處理

采用水上蒸餾的方法，將油樟葉用水蒸氣蒸餾3 h除去揮發(fā)油，殘?jiān)?0℃烘干，粉碎，取60～80目油樟葉粉末，加石油醚(沸程30～60℃)索氏抽提1 h脫脂，殘?jiān)?0℃烘干，即得脫油油樟葉粉，待用。

1.2.2 油樟葉多糖含量的測(cè)定

精密稱取D(+)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取14.0 mL至100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻即得0.07 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別至10 mL容量瓶中，用蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚，搖勻后迅速加入5.0 mL濃H2SO4，充分混合均勻，室溫放置20 min，以2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液同法顯色作空白對(duì)照。在489 nm處測(cè)定吸光度A，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度c(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為A=0.731 6c-0.052 4，R2=0.999 3。

將油樟葉多糖提取液定容至250 mL，吸取2.5 mL稀釋定容至50 mL，取定容液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的顯色操作，測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品溶液中的多糖含量，計(jì)算多糖提取量。

多糖提取率/%=［提取液中多糖含量(g)/脫油油樟葉干粉質(zhì)量(g)］×100

1.2.3 油樟葉多糖的提取工藝流程

脫油油樟葉粉→加入水→浸泡→回流提取→過濾→濾液減壓濃縮→Sevage法去蛋白→體積分?jǐn)?shù)80%乙醇沉淀→無水乙醇洗滌沉淀→真空冷凍干燥→粗多糖

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

考察提取溫度(40、55、70、85、100 ℃)、液料比［(5、10、15、20、25)∶(mL∶g)］、浸泡時(shí)間(0、30、60、90、120 min)和提取時(shí)間(30、80、130、180、230 min)對(duì)油樟葉多糖提取率的影響。

1.2.5 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取溫度、料液比、浸泡時(shí)間和提取時(shí)間4個(gè)因素，參考文獻(xiàn)［10］，選取(108)表安排試驗(yàn)，對(duì)油樟葉總多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，并根據(jù)優(yōu)選條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 油樟葉多糖體外抗自由基活性

(1)DPPH自由基清除活性參考馬金寶等［11］方法，取2.0 mL不同濃度多糖水溶液，在517 nm處測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的清除活性，陽性對(duì)照組用同等濃度VC代替多糖溶液，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。DPPH自由基清除率(E，%)計(jì)算:

E/%=［1-(A2-A1)/A0］×100

式中:A0為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL溶劑的吸光度值;A1為2 mL待測(cè)溶液+2 mL溶劑的吸光度值;A2為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL待測(cè)溶液的吸光度值。

(2)超氧陰離子自由基清除活性采用鄰苯三酚自氧化法［12］，取1.0 mL不同濃度多糖水溶液，在320 nm處測(cè)定其對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性，空白對(duì)照組用等體積Tris-Hcl溶液代替多糖溶液，陽性對(duì)照組用同等濃度VC代替多糖溶液，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。超氧陰離子自由基清除率(E，%)計(jì)算:

E/%=(A2-A1)/A2×100

式中:A2為空白對(duì)照的吸光度值;A1為待測(cè)溶液的吸光度值。

(3)羥基自由基清除活性采用 Fenton法［13］，取1.0 mL不同濃度多糖水溶液，在510 nm處測(cè)定其對(duì)羥基自由基的清除活性，以蒸餾水為空白對(duì)照，陽性對(duì)照組用同等濃度VC代替，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。羥基自由基清除率(E，%)計(jì)算:

E/%=［1-(A2-A1)/A0］×100

式中:A0為蒸餾水空白對(duì)照的吸光度值;A1為l.0 mL 9 mmol/L FeSO4+1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL待測(cè)溶液+1.0 mL蒸餾水的吸光度值;A2為1.0 mL 9 mmol/L FeSO4+l.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液+1.0 mL待測(cè)溶液+1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2的吸光度值。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用DPS7.05統(tǒng)計(jì)軟件的二次多項(xiàng)式逐步回歸模型分析均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用數(shù)量型數(shù)據(jù)幾值分析模型計(jì)算各測(cè)試物對(duì)自由基的半數(shù)清除濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1-a可知，在固定液料比15∶1(mL∶g)、浸泡時(shí)間 30 min、提取時(shí)間180 min條件下，隨著提取溫度的升高，油樟葉多糖分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加劇，溶出量增加，油樟葉多糖提取率呈線性增加，100℃達(dá)最高為12.65%。表明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)溫度對(duì)多糖提取率影響顯著，多糖提取率隨溫度增加而增加，但溫度超過100℃，可能對(duì)多糖的穩(wěn)定性和活性產(chǎn)生影響［14］，因此，多糖優(yōu)選提取溫度控制在100℃為宜。

由圖1-b可知，在固定提取溫度95℃，浸泡時(shí)間30 min，提取時(shí)間180 min條件下，油樟葉多糖提取率隨著液料比的增加而增加，液料比超過15∶1時(shí)，大部分油樟葉多糖已溶出，溶劑與材料中多糖的濃度差變小，多糖提取率增幅減小。在液料比達(dá)20∶1時(shí)，多糖提取率最高達(dá)13.65%。超過此液料比后多糖提取率略有下降，可能是液料比過大時(shí)，雜質(zhì)溶出增加，相當(dāng)于多糖被稀釋，得率反而降低［15］。因此，優(yōu)選液料比為20∶1(mL∶g)。

由圖1-c可知，在固定提取溫度95℃，液料比15∶1，提取時(shí)間180 min條件下，油樟葉多糖提取率先隨浸泡時(shí)間的延長而緩慢升高，浸泡60 min時(shí)多糖提取率最高達(dá)12.01%，此后多糖提取率緩慢下降。因此，浸泡時(shí)間以60 min為宜。但在實(shí)驗(yàn)所設(shè)浸泡時(shí)間范圍內(nèi)，由于油樟葉粉末粒度較小，溶劑分子能較快擴(kuò)散到物料內(nèi)部，迅速進(jìn)入多糖動(dòng)力學(xué)溶出過程，多糖提取率變化幅度較小。

圖1 提取溫度(a)、液料比(b)、浸泡時(shí)間(c)和提取時(shí)間(d)對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature，liquid-solid ratio，immersion time and extraction time on the extraction rate of polysaccharides

由圖1-d可知，在固定提取溫度95℃，液料比15∶1，浸泡時(shí)間30 min條件下，多糖提取率隨提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)先緩慢增加后下降趨勢(shì)，180 min時(shí)提取率最高達(dá)7.99%。表明時(shí)間過短，多糖溶出不充分;時(shí)間過長，引起多糖結(jié)構(gòu)變化而使提取率下降。因此，優(yōu)選提取溫度為180 min。在實(shí)驗(yàn)所設(shè)提取時(shí)間范圍內(nèi)，多糖提取率變化幅度不大。

2.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 數(shù)學(xué)回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化油樟多糖提取工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)安排與結(jié)果Table 1 Design matrix and results of uniformed design test

由表1可知，油樟多糖提取率最高實(shí)驗(yàn)組合為提取溫度100℃，液料比23 mL/g，浸泡時(shí)間60 min，提取時(shí)間155 min，提取率為14.06%。采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得油樟葉多糖提工藝參數(shù)的回歸方程:

回歸方程相關(guān)系數(shù)R=0.998 0，F(xiàn)=71.331 1，P=0.013 9＜0.05，Durbin-Watson統(tǒng)計(jì)量d=1.743 6，接近2，多元回歸模型可用。在建立多元回歸模型的同時(shí)進(jìn)行通徑分析，決定系數(shù)R2=0.996 0，剩余通徑系數(shù)ρe=0.063 1，通徑分析成立。表明上述回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以反映多元線性回歸模型，回歸分析有效。

由上述回歸方程可知，X3和X4未入選方程，表明在實(shí)驗(yàn)所選因素水平范圍內(nèi)，浸泡時(shí)間(X3)和提取時(shí)間(X4)對(duì)油樟葉多糖提取率無顯著影響，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

對(duì)上述模型進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表2。由表2可知，從偏相關(guān)系數(shù)大小來看，提取溫度(X1)對(duì)多糖提取率的影響大于液料比(X2)，前者的影響達(dá)到顯著水平(P≤0.05)。提取溫度與提取時(shí)間的交互影響達(dá)到顯著水平(P≤0.05)，液料比與浸泡時(shí)間、浸泡時(shí)間與提取時(shí)間之間存在交互作用，但對(duì)多糖提取率影響不顯著(P＞0.05)。

表2 各因素的顯著性檢驗(yàn)Table 2 Significance of each variable term in the fitted regression equation for he extraction rate of polysaccharides

2.2.2 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證

通過DPS軟件求解上述回歸方程，得到油樟葉多糖提取工藝的優(yōu)化條件為:提取溫度100℃，液料比16∶1(mL∶g)，浸泡時(shí)間 0 min，提取時(shí)間 215 min，多糖提取率模型預(yù)測(cè)值為15.73%。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得實(shí)際多糖提取率為14.36%，與預(yù)測(cè)值相近，且高于均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中多糖提取率最高的組合(提取率為14.06%)，表明均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)獲得的多元回歸模型可用于油樟葉多糖提取工藝的優(yōu)化。優(yōu)化的油樟葉多糖提取工藝的驗(yàn)證結(jié)果表明油樟葉中含有較豐富的多糖成分，其含量略高于香樟葉中總多糖含量(12.94%)［16］。

2.3 抗自由基活性

以優(yōu)化工藝制備油樟葉多糖提取液，經(jīng)濃縮、去蛋白、乙醇沉淀、洗滌和真空冷凍干燥得到黃褐色粉末狀油樟葉粗多糖，粗多糖得率為10.32%，多糖純度為318.40 mg/g?？梢?，多糖提取液經(jīng)后續(xù)工藝處理后損失較大，需要進(jìn)一步對(duì)后續(xù)工藝進(jìn)行優(yōu)化。

由圖2-a可知，油樟葉多糖對(duì)DPPH自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，在低濃度范圍內(nèi)與VC的清除能力差異較明顯，質(zhì)量濃度達(dá)0.2 mg/mL后，清除率逐漸接近VC。當(dāng)多糖濃度達(dá)1.6 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)90.00%，表明油樟葉多糖在高濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)。這一趨勢(shì)與紫椴花多糖清除DPPH自由基結(jié)果相似［15］。由表3可知，油樟葉多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度有較明顯的線性關(guān)系(R=0.941 7)，其 EC50為0.086 mg/mL，但仍不如VC的清除能力強(qiáng)(VC的EC50為0.002 mg/mL)。自由基清除劑通過轉(zhuǎn)移傳遞電子或氫原子給DPPH來中和其自由基［17］，因此，以上結(jié)果表明油樟多糖可能有較強(qiáng)的供氫能力。

圖2 油樟葉多糖的體外清除自由基活性Fig.2 Radical scavenging activities of polysaccharides from C.longepaniculatum in vitro

由圖2-b可知，在鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系中，油樟葉多糖具有一定清除超氧陰離子自由基作用，其清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除率低于60%，而VC在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)的清除率達(dá)69.80%。在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，油樟多糖與VC對(duì)超氧陰離子的清除能力較為接近，質(zhì)量濃度大于0.4 mg/mL后其抑制率明顯低于VC?？梢姡驼炼嗵菍?duì)超氧陰離子自由基清除能力與VC有較大差距，在低質(zhì)量濃度內(nèi)有相對(duì)較強(qiáng)清除能力［18］。油樟多糖對(duì)超氧陰離子自由基的EC50為1.075 mg/mL，大于VC的6倍(表3)。

由圖1-c和表3可知，油樟多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而呈線性增強(qiáng)(R=0.986 9)，當(dāng)質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基清除率達(dá)80.20%，但明顯低于同濃度VC的清除率(95.30%)。幾率值分析計(jì)算出油樟多糖和VC對(duì)羥自由基EC50分別為0.905、0.140 mg/mL?？梢?，油樟多糖對(duì)羥自由基具有一定清除作用，但其清除能力弱于VC。

表3 油樟葉多糖對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的半數(shù)清除濃度Table 3 The half scavenging concentration of polysaccharides from C.longepaniculatum on DPPH·，O2-· and·OH

3 結(jié)論

采用熱水浸提法，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度、液料比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間為自變量，多糖提取率為考察指標(biāo)，經(jīng)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化油樟葉多糖的提取工藝條件為提取溫度100℃、液料比16∶1(mL∶g)、浸泡時(shí)間0 min、提取時(shí)間215 min，多糖提取率為14.36%，與模型預(yù)測(cè)值接近，回歸模型能較準(zhǔn)確地?cái)M合油樟葉多糖的提取工藝。

采用化學(xué)比色法，以VC為陽性對(duì)照，測(cè)定油樟葉多糖對(duì)不同自由基的體外清除能力，表明在不同抗自由基體系中油樟葉多糖表現(xiàn)出不同的清除能力，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，對(duì)DPPH、超氧陰離子和羥基自由基的 EC50分別為0.086、1.075、0.905 mg/mL，其清除能力均低于VC?？梢姡驼寥~多糖具有一定抗自由基活性，對(duì)油樟多糖的進(jìn)一步研究與開發(fā)具有重要意義。

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