孟 凡，靳宏輝

采用析因設(shè)計(jì)研究瑞氏-吉姆薩染色法的影響因素

孟 凡，靳宏輝

目的：探討離子強(qiáng)度和溫度對(duì)瑞氏-吉姆薩（Wright-Giemsa）染色法的影響。方法：采用兩因素三水平析因設(shè)計(jì)方法，分別探討磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的3個(gè)水平對(duì)染色效果的影響，選出較優(yōu)的濃度，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)找到瑞氏染液的最適合溫度。結(jié)果：稀釋20倍的A工作液與稀釋20倍的B工作液（即A1B1組合）的染色效果優(yōu)于其他組合，實(shí)驗(yàn)溫度在32～36℃時(shí)，染色效果較佳。結(jié)論：采用實(shí)驗(yàn)修改后的瑞吉染色配方和染色條件做血片染色、血液細(xì)胞漿染色，顆粒特征明顯，細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，值得在醫(yī)院血液實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

瑞氏-吉姆薩染色；析因設(shè)計(jì)；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀；離子強(qiáng)度；溫度

0 引言

為了觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)（胞質(zhì)內(nèi)的顆粒、細(xì)胞核、染色質(zhì)等），識(shí)別各種細(xì)胞的正常及異常變化，對(duì)血涂片及骨髓片等要進(jìn)行染色，目前臨床檢驗(yàn)中最常用的是瑞氏染色法，甚至為了提高細(xì)胞核及寄生蟲的染色效果，將瑞氏染液與吉姆薩染液聯(lián)用即瑞氏-吉姆薩（Wright Giemsa）染色）[1]。影響瑞氏染色的因素很多，染色的好壞與染色液、緩沖液的質(zhì)量及比例、加液間隔時(shí)間、保持玻片染色液面的張力等染色技巧均有重大關(guān)系[2-3]。為了提高染色效果、探討最優(yōu)染色條件、達(dá)到正確識(shí)別細(xì)胞和鑒別細(xì)胞，我們重點(diǎn)研究緩沖液的離子強(qiáng)度、實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)染色的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本

隨機(jī)選取當(dāng)日門診血常規(guī)標(biāo)本。

1.1.2 儀器

TL型電熱恒溫水浴箱（姜堰市天力醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)600-AB）、電子天平（上海精密化儀器科學(xué)有限公司，型號(hào)JY4001）。

1.1.3 試劑

磷酸二氫鉀（成都市科龍化工試劑廠，分子量136.09，批號(hào)20101201）、磷酸氫二鈉（成都市科龍化工試劑廠，分子量358.14，批號(hào)20101123）、蒸餾水、瑞氏染液1液。

1.1.4 器材

100和500 ml量筒、5 ml移液管、1 000 ml容量瓶、洗耳球、染色缸、pH試紙（上海三愛(ài)思試劑有限公司，批號(hào)20100805）、載玻片、毛細(xì)管。

1.1.5 標(biāo)本制備

（1）用毛細(xì)管在距載玻片一端1 cm處加一滴（約0.05 ml）EDTA抗凝全血，左手執(zhí)載玻片，右手持推片接近血滴，使血液沿推片邊緣展開成適當(dāng)?shù)膶挾?，立即將推片與載玻片呈30～45°角，勻速將血液推成厚薄適宜的血涂片，血涂片應(yīng)厚薄適宜、分布均勻、頭體尾明顯、邊緣整齊，兩邊留有一定的空隙。

（2）在載玻片的一端用記號(hào)筆編號(hào)。（3）待自然干燥后備用。

1.1.6 試劑準(zhǔn)備

用電子天平準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉4 g（A工作液）、磷酸二氫鉀6 g（B工作液）于容量瓶中，加新鮮蒸餾水至1 000 ml并攪拌至其溶解，混勻待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀兩因素三水平（2× 3）析因設(shè)計(jì)

設(shè)定磷酸氫二鈉為A，磷酸二氫鉀為B，其各自有3個(gè)實(shí)驗(yàn)水平，分別為A1、A2、A3，B1、B2、B3，則其實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵姳?。

表1 AB（2×3）析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

按照此模型，取相應(yīng)量的各試劑配制成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組合，再加用新鮮蒸餾水做對(duì)照（溶液編號(hào)：10）。AB（2×3）析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程見表2。

表2 AB（2×3）析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程

1.2.2 染色

將染液1液（瑞氏染料）裝入染色缸中，放入36℃恒溫水浴箱中，染液2液（緩沖液）同1液的操作步驟，待二者的溫度均保持在36℃時(shí)，將血涂片放入1液池45 s后再放入2液池，染色90 s后取出，待自然干燥后鏡檢觀察結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果

離子強(qiáng)度對(duì)染色影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 離子強(qiáng)度對(duì)染色影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 A1B1組合

圖2 A2B2組合

圖3 A3B3組合

1.2.4 研究實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)染色結(jié)果的影響

（1）取A1B1濃度的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀裝入染色缸中，置于26℃的水浴箱中，其余染色步驟同1.2.2。

（2）取A1B1濃度的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀裝入染色缸中，置于28℃的水浴箱中，其余染色步驟同1.1.2。

（3）取A1B1濃度的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀裝入染色缸中，置于30℃的水浴箱中，其余染色步驟同1.1.2。

（4）取A1B1濃度的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀裝入染色缸中，置于32℃的水浴箱中，其余染色步驟同1.1.2。

（5）取A1B1濃度的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀裝入染色缸中，置于36℃的水浴箱中，其余染色步驟同1.1.2。

（6）取A1B1濃度的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀裝入染色缸中，置于40℃的水浴箱中，其余染色步驟同1.1.2。

1.2.5 結(jié)果

溫度對(duì)染色影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 溫度對(duì)染色影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 36℃染色效果（最好）

圖5 40℃染色效果（欠佳）

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：原工作液的濃度較大，染色效果較差，有核細(xì)胞的細(xì)胞核著色不良，顆粒模糊不清，稀釋20倍的A工作液與稀釋20倍的B工作液（即A1B1組合）的染色效果優(yōu)于其他組合。實(shí)驗(yàn)溫度在32～ 36℃時(shí)，染色效果較佳，溫度較低時(shí)，有核細(xì)胞著色不良，細(xì)胞核及顆粒顏色偏淺，模糊不清；當(dāng)溫度過(guò)高（大于40℃時(shí)），細(xì)胞著色偏深，核染色質(zhì)不清晰。

3 討論

（1）析因設(shè)計(jì)方法在現(xiàn)今的科研中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。析因設(shè)計(jì)的最大優(yōu)點(diǎn)是所獲得的信息量很多，可以準(zhǔn)確地估計(jì)各實(shí)驗(yàn)因素的主效應(yīng)的大小，還可估計(jì)因素之間各級(jí)交互作用效應(yīng)的大小[4]，當(dāng)然也有其缺點(diǎn)，就是所需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù)多，因此耗費(fèi)的人力、物力和時(shí)間也較多。

（2）細(xì)胞的主要成分為蛋白質(zhì)，離子強(qiáng)度會(huì)對(duì)其有影響，當(dāng)緩沖液的濃度越大，即離子強(qiáng)度越大時(shí)，離子間的相互作用越強(qiáng)，產(chǎn)生的排斥力越大，那么就會(huì)降低染料與細(xì)胞的結(jié)合，同時(shí)緩沖液的濃度較低時(shí)，還能促使帶有電荷的染料滲入細(xì)胞內(nèi)，使其更易著色[5]。

（3）在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將pH值對(duì)其的影響也進(jìn)行了簡(jiǎn)單的探討，在pH值為6.0～6.8時(shí)，得到了不錯(cuò)的染色效果。當(dāng)pH值＜6.0時(shí)，緩沖液越偏酸性，細(xì)胞染色越偏紅，因?yàn)榧?xì)胞的主要成分屬蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液pH而定，當(dāng)pH小于等電點(diǎn)（isoelectric point，PI）時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；當(dāng)pH值＞6.8時(shí)，緩沖液越偏堿性，細(xì)胞染色越偏藍(lán)，因?yàn)楫?dāng)pH大于PI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)或天青B結(jié)合，染色偏藍(lán)[6-7]。

（4）將實(shí)驗(yàn)設(shè)在6個(gè)不同的溫度中進(jìn)行，可以看出當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度在32～36℃時(shí)，細(xì)胞的染色效果較佳。在溫度較低時(shí)，細(xì)胞著色不良，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，細(xì)胞著色較深，因?yàn)樵跐舛纫欢〞r(shí)，升高溫度，反應(yīng)物分子的能量增加，使一部分原來(lái)能量較低的分子變成活化分子，從而增加了反應(yīng)物分子中活化分子的數(shù)量，使有效碰撞的次數(shù)增多，因而化學(xué)反應(yīng)速率增快，反之，速率減慢[8]。

（5）為了能使細(xì)胞核與寄生蟲著色更好，在40ml瑞氏染液中加入0.5 g的吉姆薩染料，用標(biāo)準(zhǔn)濃度的緩沖液，染色步驟同1.2.2。鏡檢后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞著色效果較之前無(wú)明顯改變，然后用瑞氏染液將配制好的瑞吉染液按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8進(jìn)行稀釋，然后同上述染色步驟染色，鏡檢后發(fā)現(xiàn)1∶1的稀釋倍數(shù)染色效果較佳，表現(xiàn)為：正常成熟紅細(xì)胞呈粉紅色，中性粒細(xì)胞顆粒呈淡紫紅色，核呈紫紅色，嗜酸性顆粒呈橘黃色，嗜堿性顆粒呈暗紫色，單核細(xì)胞的胞漿顆粒呈細(xì)小淡紫紅色，核呈紫紅色，淋巴細(xì)胞核呈紫紅色[9]。

綜上所述，通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出：當(dāng)把緩沖液的原液稀釋20倍時(shí)染色效果較佳；緩沖液的pH值在6.0～6.8時(shí)染色效果較佳[10]；實(shí)驗(yàn)溫度控制在32～36℃時(shí)染色效果較佳。通過(guò)在瑞氏染液中加入一定量的吉姆薩染料，可以使細(xì)胞核染色效果更好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著醫(yī)學(xué)事業(yè)的快速發(fā)展，檢驗(yàn)行業(yè)不僅需要提高檢驗(yàn)效率，更要保證檢驗(yàn)質(zhì)量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究影響瑞氏染色的主要因素，并且找出各因素的最佳值，使血涂片和骨髓片的染色效果得到提升，方便對(duì)細(xì)胞的正確辨別，有助于臨床工作的開展。

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（收稿：2014-11-20 修回：2015-03-15）

Research on influence factors of Wright-Giemsa staining method by factorial design

MENG Fan,JIN Hong-hui
(Institution Hospital of Chengdu Military Area Command,Chengdu 610000,China)

ObjectiveTo investigate the influences of ionic strength and temperature on Wright-Giemsa staining method.MethodsThe dyeing effects of three levels of sodium dihydrogen phosphate and potassium hydrogen phosphate were evaluated using two factors and three level factorial design methods for choosing the optimal concentration.A series of experiments were conducted to find the optimum concentration and temperature for Wright's staining.ResultsThe combination of solution A and B diluted for 20 times(A1B1)had better dyeing effects than other combinations,especially when the experimental temperature was from 32 to 36℃.ConclusionDyeing effect can be enhanced by using the modified Wright's staining and recommended temperature above mentioned,which are worthy popularizing and appling in hospital blood laboratory.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（8）：124-126]

Wright's staining method;factorial design;sodium dihydrogen phosphate;potassium hydrogen phosphate;ionic strength;temperature

R318；R197.39

A

1003-8868（2015）08-0124-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.08.124

孟 凡（1982—），女，檢驗(yàn)師，主要從事血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的研究工作。

610000成都，成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院（孟 凡，靳宏輝）